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Pesquisador: Alex Balduino de Souza/ Instituto: INTO
Novo Método de Isolamento de Células-Tronco Mesenquimais Multipotentes da Medula Óssea Humana para Aplicação em Protocolos de Terapia Celular
As células-tronco mesenquimais da medula óssea são definidas pela sua capacidade de adesão ao substrato e pelo potencial de diferenciação em osteoblastos, condrócitos e adipócitos. Estas características fazem destas células o principal foco de estudo e desenvolvimento de futuros protocolos de terapia celular, principalmente àqueles aplicados aos tecidos músculo-esqueléticos. Embora amplamente utilizado, o protocolo clássico de isolamento/expansão de células-tronco e progenitores mesenquimais da medula óssea, assim como em outros tecidos (tecido adiposo, sangue de cordão umbilical, etc.), não garante a pureza nem a homogeneidade de uma população de células verdadeiramente multipotentes.
Através de ensaios clonogênicos (CFU-F), associados a ensaios de diferenciação in vitro e in vivo, sabemos que o atual método permite o isolamento de uma população heterogênea de células-tronco e de progenitores comprometidos bi- ou unipotentes. Esta heterogeneidade restringe sua aplicação em estudos da regeneração do tecido ósseo, impede o desenvolvimento adequado de novos protocolos de diferenciação em outros tipos celulares dos tecidos músculo-esqueléticos (condrócitos, osteoblastos e células musculares) e dificulta a elaboração de protocolos clínicos de pesquisas com células expandidas. Ademais, a utilização de uma população heterogênea de células mesenquimais aumenta o risco de diferenciação indesejada e propostas com resultados clínicos pouco eficazes e de difícil reprodução.
Embora identificadas como células distintas, as células-tronco mesenquimais e os pericitos (células perivasculares) apresentam ampla similaridade quanto o fenótipo e o potencial de diferenciação em células dos tecidos músculo-esqueléticos. Diferentes grupos descrevem que os pericitos isolados de músculo estriado esqueléticos apresentam adesão tardia (somente após 5 dias) quando comparados com os mioblastos, que são os precursores diretos da fibra muscular. Com base nestes dados, nossa principal hipótese é que as células-tronco mesenquimais multipotentes da medula óssea, assim como os pericitos, apresentam adesão tardia quando comparadas com os outros progenitores mesenquimais comprometidos.
O novo método proposto no presente projeto permitirá o isolamento, expansão e caracterização adequada da população de células mesenquimais multipotentes da medula óssea. Ademais, a purificação desta população será essencial para os estudos dos marcadores e dos mecanismos de diferenciação dessas células, e servirão, principalmente, como base para ampliar o espectro de novas terapias celulares para outros tecidos músculo-esqueléticos, além do tecido ósseo. Este novo protocolo permitirá que o potencial de diferenciação não-ortodoxo destas células (diferenciação em neurônios, células da glia, cardiomiócitos) seja efetiva e adequadamente avaliado.
Através de ensaios clonogênicos (CFU-F), associados a ensaios de diferenciação in vitro e in vivo, sabemos que o atual método permite o isolamento de uma população heterogênea de células-tronco e de progenitores comprometidos bi- ou unipotentes. Esta heterogeneidade restringe sua aplicação em estudos da regeneração do tecido ósseo, impede o desenvolvimento adequado de novos protocolos de diferenciação em outros tipos celulares dos tecidos músculo-esqueléticos (condrócitos, osteoblastos e células musculares) e dificulta a elaboração de protocolos clínicos de pesquisas com células expandidas. Ademais, a utilização de uma população heterogênea de células mesenquimais aumenta o risco de diferenciação indesejada e propostas com resultados clínicos pouco eficazes e de difícil reprodução.
Embora identificadas como células distintas, as células-tronco mesenquimais e os pericitos (células perivasculares) apresentam ampla similaridade quanto o fenótipo e o potencial de diferenciação em células dos tecidos músculo-esqueléticos. Diferentes grupos descrevem que os pericitos isolados de músculo estriado esqueléticos apresentam adesão tardia (somente após 5 dias) quando comparados com os mioblastos, que são os precursores diretos da fibra muscular. Com base nestes dados, nossa principal hipótese é que as células-tronco mesenquimais multipotentes da medula óssea, assim como os pericitos, apresentam adesão tardia quando comparadas com os outros progenitores mesenquimais comprometidos.
O novo método proposto no presente projeto permitirá o isolamento, expansão e caracterização adequada da população de células mesenquimais multipotentes da medula óssea. Ademais, a purificação desta população será essencial para os estudos dos marcadores e dos mecanismos de diferenciação dessas células, e servirão, principalmente, como base para ampliar o espectro de novas terapias celulares para outros tecidos músculo-esqueléticos, além do tecido ósseo. Este novo protocolo permitirá que o potencial de diferenciação não-ortodoxo destas células (diferenciação em neurônios, células da glia, cardiomiócitos) seja efetiva e adequadamente avaliado.
Pesquisador: Alexander Henning Ulrich/ Instituto: USP
Bases moleculares da diferenciação de células-tronco e progenitoras neurais na terapia celular
O sistema nervoso é formado por uma rede composta de trilhões de neurônios com diferentes fenótipos e outros tipos celulares de sustentação. A imensa variedade fenotípica de células no sistema nervoso é devida ao desenvolvimento diferencial de células-tronco e progenitoras que originam neurônios, astrócitos e oligodendrócitos. Esse processo de neurogênese é direcionado pela ativação de inúmeros receptores das células em diferenciação.
A participação de receptores de neuropeptídeos e neurotransmissores, tais como o receptor B2 de cininas, purinérgicos e colinérgicos, foi estudada e caracterizada por este laboratório durante a diferenciação neuronal no modelo de células P19 de carcinoma embrionário. Com base nos dados obtidos, propomos o estudo da participação destes receptores na diferenciação neural de células-tronco embrionárias, de células mesenquimais do tecido adiposo humano e de rato assim como o processo de maturação de neurônios funcionais a partir de células progenitoras neurais de rato (neuroesferas). Para tal, serão desenvolvidos aptâmeros de DNA usando a técnica SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) a partir de uma biblioteca combinatória de DNA com capacidade de ligação específica às células-tronco. Posteriormente, essas moléculas serão utilizadas para a purificação destas células a partir do tecido adiposo.
A segunda etapa do projeto envolve a aplicação de células-tronco mesenquimais e progenitoras neurais purificadas in vivo em lesões de nervo periférico ciático de ratos a fim de elucidar o potencial terapêutico destes modelos. Além disso, será avaliada a capacidade das células-tronco e progenitoras originarem processos regenerativos no sistema nervoso periférico.
A participação de receptores de neuropeptídeos e neurotransmissores, tais como o receptor B2 de cininas, purinérgicos e colinérgicos, foi estudada e caracterizada por este laboratório durante a diferenciação neuronal no modelo de células P19 de carcinoma embrionário. Com base nos dados obtidos, propomos o estudo da participação destes receptores na diferenciação neural de células-tronco embrionárias, de células mesenquimais do tecido adiposo humano e de rato assim como o processo de maturação de neurônios funcionais a partir de células progenitoras neurais de rato (neuroesferas). Para tal, serão desenvolvidos aptâmeros de DNA usando a técnica SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) a partir de uma biblioteca combinatória de DNA com capacidade de ligação específica às células-tronco. Posteriormente, essas moléculas serão utilizadas para a purificação destas células a partir do tecido adiposo.
A segunda etapa do projeto envolve a aplicação de células-tronco mesenquimais e progenitoras neurais purificadas in vivo em lesões de nervo periférico ciático de ratos a fim de elucidar o potencial terapêutico destes modelos. Além disso, será avaliada a capacidade das células-tronco e progenitoras originarem processos regenerativos no sistema nervoso periférico.
Pesquisador: Alfredo Miranda de Góes/ Instituto: UFMG
Desenvolvimento de Constructos de Engenharia de Tecido por Cultivo de Células Tronco do Tecido Adiposo Humano em Biomateriais de Estrutura Tridimensional
O presente projeto é centrado no desenvolvimento de estratégias de engenharia de tecido ósseo baseadas na cultura in vitro de células-tronco do tecido adiposo humanas previamente cultivadas em arcabouços (scaffolds) tridimensionais. Trabalhos relevantes demonstraram que células indiferenciadas provenientes do produto de lipoaspiração são capazes de se diferenciar na linhagem condrogênica, osteogênica, adipogênica e miogênica sugerindo sua aplicabilidade na reconstituição de tecidos. A estratégia de engenharia de tecido utilizada neste projeto permite que as células adiram ao suporte, proliferem e segreguem matriz extracelular específica do tecido ósseo, até se obter um substituto artificial funcional com características do tecido original, que, pode, finalmente, ser transplantado para tratar o defeito em causa.
Por isso, os principais objetivos desse projeto são: (i) desenvolvimento de scaffolds biodegradáveis a partir de novos polímeros naturais à base de cana-de-açúcar e quitosana que induzam a adesão e a proliferação celular e que apresentem propriedades adequadas, tais como a porosidade e a interconectividade, de forma a proporcionar um ambiente que favoreça o desenvolvimento in vitro de um material híbrido com características similares ao osso humano; (ii) estudo da utilização de células-tronco do tecido adiposo humano como uma fonte alternativa de células para a engenharia de tecido ósseo; (iii) determinar diferenciação, sobrevivência e proliferação das células-tronco do tecido adiposo humano nos scaffolds tridimensionais; (iv) avaliar a expressão gênica diferencial das células-tronco após a diferenciação em osteoblastos nos biomateriais propostos usando a técnica de RaSH; (v) avaliar o perfil de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias no receptor por técnica de PCR em tempo real e ELISA no modelo de estudo após o implante ósseo; (vi) avaliar o processo de recuperação óssea em ratas ovariectomizadas (osteoporose) após o implante do biomaterial das células-tronco.
Esses objetivos convergem para o objetivo geral do projeto que consiste no desenvolvimento de uma terapia de engenharia de tecido ósseo, alternativa às existentes, com potencial para vir a ser posteriormente utilizada na prática clínica e que impliquem num menor custo e reabilitação dos pacientes.
Por isso, os principais objetivos desse projeto são: (i) desenvolvimento de scaffolds biodegradáveis a partir de novos polímeros naturais à base de cana-de-açúcar e quitosana que induzam a adesão e a proliferação celular e que apresentem propriedades adequadas, tais como a porosidade e a interconectividade, de forma a proporcionar um ambiente que favoreça o desenvolvimento in vitro de um material híbrido com características similares ao osso humano; (ii) estudo da utilização de células-tronco do tecido adiposo humano como uma fonte alternativa de células para a engenharia de tecido ósseo; (iii) determinar diferenciação, sobrevivência e proliferação das células-tronco do tecido adiposo humano nos scaffolds tridimensionais; (iv) avaliar a expressão gênica diferencial das células-tronco após a diferenciação em osteoblastos nos biomateriais propostos usando a técnica de RaSH; (v) avaliar o perfil de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias no receptor por técnica de PCR em tempo real e ELISA no modelo de estudo após o implante ósseo; (vi) avaliar o processo de recuperação óssea em ratas ovariectomizadas (osteoporose) após o implante do biomaterial das células-tronco.
Esses objetivos convergem para o objetivo geral do projeto que consiste no desenvolvimento de uma terapia de engenharia de tecido ósseo, alternativa às existentes, com potencial para vir a ser posteriormente utilizada na prática clínica e que impliquem num menor custo e reabilitação dos pacientes.
Pesquisador: Ana Maria Blanco Martinez/ Instituto: UFRJ
Neurociência Restaurativa: Estratégias de Transplante Celular em Modelos Animais de Lesão de Nervos Ciático e Mediano e de Medula Espinal em Camundongos
Apesar dos avanços nos protocolos cirúrgicos e em cuidados gerais dispensados aos pacientes portadores de lesão de medula espinal, ainda não dispomos de terapias eficazes para utilização na clínica humana (Thuret et al., 2006; Andrés et al., 2008; Eftekharpour et al., 2008). Nas últimas décadas tem havido um avanço na busca por terapias celulares que restabeleçam as funções perdidas por esses pacientes. Células-tronco, de diferentes origens, surgem como fontes potenciais de restituição de células perdidas, como neurônios e oligodendrócitos, que possam restabelecer contatos perdidos, construir novos circuitos e/ou remielinizar axônios poupados, acarretando uma melhora funcional importante (Bradbury and McMahan, 2006; Cizkova et al., 2006; Li et al., 2007; Raisman and Li, 200).
Além disso, essas células podem liberar fatores tróficos que, alternativamente, podem (a) combater os efeitos inibitórios de matriz extracelular, particularmente em áreas de astrogliose, (b) neutralizar os efeitos anti-regenerativos de substâncias liberadas pelos oligodendrócitos, (c) induzir, “in vivo”, diferenciação neural das células implantadas, (d) promover a diferenciação de células progenitoras neurais do hospedeiro, entre outras ações. Essas células podem ser obtidas de blastocistos, fetos e tecidos adultos de linhagens diversificadas. Estudos experimentais pré-clínicos têm mostrado resultados promissores no tratamento de lesões traumáticas de medula espinal e nervos periféricos.
Entretanto, existe uma diversidade muito grande de modelos experimentais de lesão, de animais experimentais, de estratégias de tratamentos, de linhagens celulares e do tratamento dispensado a essas células, o que dificulta qualquer conclusão em termos do melhor protocolo para ser utilizado na clínica médica. Nosso desenho experimental consiste em utilizar um único modelo de lesão traumática de medula espinal, estabelecido no nosso laboratório (Marques et al., 2010), aliado a tratamentos isolados ou combinados, através o uso de diferentes células-tronco.
Para tratamento de lesão de nervos periféricos utilizaremos modelo anteriormente utilizado por nosso grupo, onde células-tronco são enxertadas em nervos seccionados e tubulizados. Nossos resultados, com esta última estratégia geraram, nos animais enxertados, uma melhora significativa, tanto do ponto de vista funcional como citoarquitetônico. Esses resultados foram publicados na Experimental Neurology em 2006.
Esperamos poder continuar contribuindo com essa área de pesquisa, gerando resultados confiáveis e facilmente reprodutíveis, que possam ser traduzidos em terapias eficazes para portadores de lesões traumáticas afetando o sistema nervoso. A experiência em técnicas cirúrgicas, morfológicas e funcionais dos participantes do projeto, aliado às parcerias com laboratórios chefiados por pesquisadores que manipulam células-tronco, viabilizam o desenvolvimento do projeto proposto.
Além disso, essas células podem liberar fatores tróficos que, alternativamente, podem (a) combater os efeitos inibitórios de matriz extracelular, particularmente em áreas de astrogliose, (b) neutralizar os efeitos anti-regenerativos de substâncias liberadas pelos oligodendrócitos, (c) induzir, “in vivo”, diferenciação neural das células implantadas, (d) promover a diferenciação de células progenitoras neurais do hospedeiro, entre outras ações. Essas células podem ser obtidas de blastocistos, fetos e tecidos adultos de linhagens diversificadas. Estudos experimentais pré-clínicos têm mostrado resultados promissores no tratamento de lesões traumáticas de medula espinal e nervos periféricos.
Entretanto, existe uma diversidade muito grande de modelos experimentais de lesão, de animais experimentais, de estratégias de tratamentos, de linhagens celulares e do tratamento dispensado a essas células, o que dificulta qualquer conclusão em termos do melhor protocolo para ser utilizado na clínica médica. Nosso desenho experimental consiste em utilizar um único modelo de lesão traumática de medula espinal, estabelecido no nosso laboratório (Marques et al., 2010), aliado a tratamentos isolados ou combinados, através o uso de diferentes células-tronco.
Para tratamento de lesão de nervos periféricos utilizaremos modelo anteriormente utilizado por nosso grupo, onde células-tronco são enxertadas em nervos seccionados e tubulizados. Nossos resultados, com esta última estratégia geraram, nos animais enxertados, uma melhora significativa, tanto do ponto de vista funcional como citoarquitetônico. Esses resultados foram publicados na Experimental Neurology em 2006.
Esperamos poder continuar contribuindo com essa área de pesquisa, gerando resultados confiáveis e facilmente reprodutíveis, que possam ser traduzidos em terapias eficazes para portadores de lesões traumáticas afetando o sistema nervoso. A experiência em técnicas cirúrgicas, morfológicas e funcionais dos participantes do projeto, aliado às parcerias com laboratórios chefiados por pesquisadores que manipulam células-tronco, viabilizam o desenvolvimento do projeto proposto.
Pesquisador: Andrea Gonçalves Trentin/ Instituto: UFSC
Avaliação do Potencial Terapêutico e Biotecnológico de Células-Tronco Isoladas de Folículo Piloso Humano
Populações de células-tronco epidermais têm sido encontradas em locais específicos da pele de mamíferos como no folículo piloso onde residem em um discreto microambiente conhecido como a saliência do folículo piloso (“bulge”). As células-tronco isoladas do folículo piloso são multipotentes, podendo originar neurônios, células gliais, queratinócitos, músculo liso e melanócitos, assim como apresentam o potencial de regenerar epiderme, folículo piloso e glândulas sebáceas. Além disso, apresentam propriedades similares às das células-tronco da crista neural embrionária. Em nosso laboratório, padronizamos condições de cultura de células da saliência do folículo piloso de camundongos, nas quais identificamos, por RT-PCR e imunofluorescência, a presença de marcadores de células-tronco da crista neural como p75, nestina além de marcadores neuronais, gliais e de miofibroblastos. O folículo piloso representa ótimo modelo para estudos mais aprofundados de nichos de células-tronco e estudos destinados a identificar as condições que permitem às células adotar e manter características de células-tronco de vida longa e assim possibilitar o desenvolvimento de protocolos de regeneração e reparo da pele além de tratamentos de lesões do sistema nervoso, doenças desmielinizantes, problemas vasculares, degenerações ósseo-cartilaginosas, entre outras.
A queimadura tem sido identificada como um grande problema de saúde pública em vários países em desenvolvimento. O tratamento de queimaduras tem evoluído significativamente nos últimos anos com a melhor compreensão da fisiopatologia na fase aguda e a reposição hídrica do paciente grande queimado, com modulação da resposta imune e inflamatória. Diversas pesquisas têm sido direcionadas para a obtenção de uma “pele” integral, composta de derme e epiderme, para ser utilizada na cobertura cutânea de excisões tangenciais. Modelos de regeneração dérmica e de cultura de células foram desenvolvidos experimentalmente e em ensaios clínicos, entretanto ainda não se desenvolveu uma cobertura ideal. Assim, há necessidade de se desenvolver novos procedimentos terapêuticos. Para tanto, a compreensão dos mecanismos celulares e moleculares que controlam a diferenciação e auto-renovação das células-tronco epidermais são fundamentais.
Desse modo, no presente projeto pretendemos avaliar o potencial terapêutico e biotecnológico de células-tronco de folículos pilosos humanos. Espera-se caracterizar o folículo piloso humano como fonte acessível e autóloga de células-tronco, identificando condições de diferenciação e renovação dessas células. O projeto apresenta também uma abordagem pré-clínicas para o desenvolvimento de nova cobertura cutânea que permita a regeneração das camadas dérmicas e epidérmicas em modelo animal de camundongos. Desse modo iremos gerar conhecimento para o desenvolvimento de processos biotecnológicos e terapêuticos.
A queimadura tem sido identificada como um grande problema de saúde pública em vários países em desenvolvimento. O tratamento de queimaduras tem evoluído significativamente nos últimos anos com a melhor compreensão da fisiopatologia na fase aguda e a reposição hídrica do paciente grande queimado, com modulação da resposta imune e inflamatória. Diversas pesquisas têm sido direcionadas para a obtenção de uma “pele” integral, composta de derme e epiderme, para ser utilizada na cobertura cutânea de excisões tangenciais. Modelos de regeneração dérmica e de cultura de células foram desenvolvidos experimentalmente e em ensaios clínicos, entretanto ainda não se desenvolveu uma cobertura ideal. Assim, há necessidade de se desenvolver novos procedimentos terapêuticos. Para tanto, a compreensão dos mecanismos celulares e moleculares que controlam a diferenciação e auto-renovação das células-tronco epidermais são fundamentais.
Desse modo, no presente projeto pretendemos avaliar o potencial terapêutico e biotecnológico de células-tronco de folículos pilosos humanos. Espera-se caracterizar o folículo piloso humano como fonte acessível e autóloga de células-tronco, identificando condições de diferenciação e renovação dessas células. O projeto apresenta também uma abordagem pré-clínicas para o desenvolvimento de nova cobertura cutânea que permita a regeneração das camadas dérmicas e epidérmicas em modelo animal de camundongos. Desse modo iremos gerar conhecimento para o desenvolvimento de processos biotecnológicos e terapêuticos.
Pesquisador: Anna Carla Renata Krepel Goldberg/ Instituto: USP
Diferenciação de hepatócitos a partir de células-tronco de cordão umbilical e desenvolvimento de ensaio pré-clínico visando o transplante-ponte em pacientes com insuficiência hepática
A significante morbidade e mortalidade na lista de pacientes à espera pelo transplante de fígado, único tratamento eficaz para pacientes com insuficiência hepática, é um problema mundial em conseqüência da escassez de doadores de órgãos. Frente a esse problema, importantes centros de pesquisa em todo mundo buscam o desenvolvimento de terapias que possam dar suporte temporário às funções metabólicas do fígado, até que um órgão seja disponibilizado. O transplante de hepatócitos, que consiste na transferência de uma suspensão de hepatócitos para um fígado doente, apresenta-se como uma alternativa menos invasiva ao transplante de fígado, podendo se tornar um procedimento de rotina, a ser usado em situações de insuficiência hepática aguda, reduzindo ou eliminando os sintomas clínicos. Há relatos de sucesso em alguns casos clínicos tratados com transplante-ponte utilizando hepatócitos humanos isolados, no entanto, essa terapia tem sua aplicação limitada devido à dificuldade de se obter tais células.
Frente ao exposto, é importante buscar por fontes alternativas de hepatócitos isolados. Com o intuito de tornar o transplante de hepatócitos um procedimento de rotina para melhorar a qualidade de vida de pacientes a espera de um transplante de fígado, este projeto tem como objetivo a diferenciação de hepatócitos a partir de células-tronco mesenquimais humanas de cordão umbilical e o desenvolvimento de modelo animal de insuficiência hepática para validação do transplante-ponte de hepatócitos diferenciados.
O processo de diferenciação será monitorado in vitro através de testes funcionais, utilizando as técnicas de PCR em tempo real, para avaliação de marcadores específicos de fígado, microscopia ótica para avaliar a capacidade de produzir albumina e estocar glicogênio, além de dosagens, nos meios de cultura, de alanina transaminase, bilirrubina total, uréia e albumina. Esses testes serão feitos em células de hepatoma humano HepG2 (controle positivo), em células-tronco mesenquimais não submetidas ao protocolo de diferenciação (controle negativo) e células-tronco mesenquimais submetidas ao protocolo de diferenciação. Em paralelo aos protocolos de diferenciação, serão desenvolvidos modelos murinos de insuficiência hepática aguda (hepatectomia de 70%) e crônica (cirrose induzida por dimetilnitrosamina) para validação do transplante de hepatócitos. No modelo agudo, serão feitos 3 grupos de experimentais: transplante de células HepG2, hepatócitos diferenciados e simulação do procedimento (sham). No modelo crônico, além destes, células-tronco mesenquimais não diferenciadas também serão implantadas para avaliação da diferenciação in vivo.
O suporte metabólico dado pelas células transplantadas ao rato com insuficiência hepática, será analisado através de dosagens séricas e cortes histológicos do fígado, utilizando anticorpos que discriminam a produção de albumina humana da albumina do animal. A implantação desta metodologia abre caminho para estabelecer não só a rotina de transplante-ponte, mas, também, o desenvolvimento de microencapsulamento e criopreservação de hepatócitos para transplante e o aperfeiçoamento do próprio processo de diferenciação, através da Engenharia Tecidual, baseados em estudos já em desenvolvimento no NUCEL.
Frente ao exposto, é importante buscar por fontes alternativas de hepatócitos isolados. Com o intuito de tornar o transplante de hepatócitos um procedimento de rotina para melhorar a qualidade de vida de pacientes a espera de um transplante de fígado, este projeto tem como objetivo a diferenciação de hepatócitos a partir de células-tronco mesenquimais humanas de cordão umbilical e o desenvolvimento de modelo animal de insuficiência hepática para validação do transplante-ponte de hepatócitos diferenciados.
O processo de diferenciação será monitorado in vitro através de testes funcionais, utilizando as técnicas de PCR em tempo real, para avaliação de marcadores específicos de fígado, microscopia ótica para avaliar a capacidade de produzir albumina e estocar glicogênio, além de dosagens, nos meios de cultura, de alanina transaminase, bilirrubina total, uréia e albumina. Esses testes serão feitos em células de hepatoma humano HepG2 (controle positivo), em células-tronco mesenquimais não submetidas ao protocolo de diferenciação (controle negativo) e células-tronco mesenquimais submetidas ao protocolo de diferenciação. Em paralelo aos protocolos de diferenciação, serão desenvolvidos modelos murinos de insuficiência hepática aguda (hepatectomia de 70%) e crônica (cirrose induzida por dimetilnitrosamina) para validação do transplante de hepatócitos. No modelo agudo, serão feitos 3 grupos de experimentais: transplante de células HepG2, hepatócitos diferenciados e simulação do procedimento (sham). No modelo crônico, além destes, células-tronco mesenquimais não diferenciadas também serão implantadas para avaliação da diferenciação in vivo.
O suporte metabólico dado pelas células transplantadas ao rato com insuficiência hepática, será analisado através de dosagens séricas e cortes histológicos do fígado, utilizando anticorpos que discriminam a produção de albumina humana da albumina do animal. A implantação desta metodologia abre caminho para estabelecer não só a rotina de transplante-ponte, mas, também, o desenvolvimento de microencapsulamento e criopreservação de hepatócitos para transplante e o aperfeiçoamento do próprio processo de diferenciação, através da Engenharia Tecidual, baseados em estudos já em desenvolvimento no NUCEL.
Pesquisador: Antonio Carlos Campos de Carvalho/ Instituto: UFRJ
Células-Tronco: potencial terapêutico em doenças cardíacas
A partir da virada do milênio, a medicina regenerativa vem se configurando como uma alternativa terapêutica para doenças crônico-degenerativas. No caso específico das doenças cardíacas, devido a alta morbi-mortalidade associada, o interesse por novas perspectivas terapêuticas é muito grande. Neste contexto a terapia celular vem sendo intensamente investigada com o uso de diferentes células-tronco. Em nosso grupo, trabalhamos com aspectos básicos, pré-clínicos e clínicos da terapia celular. Na área básica investigamos mecanismos moleculares de reprogramação celular e buscamos métodos eficientes e robustos de diferenciação de células pluripotentes em cardiomiócitos, além de isolar e caracterizar células tronco/progenitoras cardíacas. Na área pré-clínica investigamos os efeitos de células tronco mesenquimais de diversas fontes e de células tronco cardíacas em modelos de doenças cardíacas, como a doença de Chagas e as doenças isquêmicas, avaliando mecanismos de ação e benefícios funcionais e estruturais. Na área clínica, utilizamos células derivadas de medula óssea em ensaios de segurança e eficácia em quatro tipos de cardiopatias: chagásica, dilatada, isquêmica crônica e aguda. Ainda na área clínica estamos derivando células pluripotentes induzidas de pacientes portadores de arritmias cardíacas e futuramente de cardiopatias hipertróficas.
Nossa hipótese de trabalho é que para uma determinada patologia cardíaca será possível encontrar um tipo de célula-tronco que possibilite ampliar as perspectivas terapêuticas do paciente para além do transplante cardíaco. Embora a célula-tronco escolhida possa não ter todas as características de uma célula ideal, será possível isolar, cultivar e expandir dentro de uma janela terapêutica adequada ao tratamento de uma determinada doença cardíaca um tipo de célula-tronco que possibilite esta alternativa terapêutica aos pacientes.
Nossa hipótese de trabalho é que para uma determinada patologia cardíaca será possível encontrar um tipo de célula-tronco que possibilite ampliar as perspectivas terapêuticas do paciente para além do transplante cardíaco. Embora a célula-tronco escolhida possa não ter todas as características de uma célula ideal, será possível isolar, cultivar e expandir dentro de uma janela terapêutica adequada ao tratamento de uma determinada doença cardíaca um tipo de célula-tronco que possibilite esta alternativa terapêutica aos pacientes.
Pesquisador: Beatriz Monteiro Longo/ Instituto: UNIFESP
Avaliação do transplante de células precursoras neurais em modelos experimentais de epilepsia
A epilepsia tem como principal característica a manifestação de crises convulsivas espontâneas e recorrentes que se desenvolvem a partir de alterações neuronais em certas áreas do sistema nervoso central (Dichter, 1997). Disparos neuronais contínuos e de alta freqüência podem ser gerados por uma disfunção sináptica inibitória circundante. A propagação da crise para além do foco original pode também ser causada por um desequilíbrio entre excitação e inibição. Portanto, as conseqüências da perda ou disfunção de interneurônios GABAérgicos no desenvolvimento do quadro epiléptico são importantes. O desequilíbrio da neurotransmissão GABAérgica, além de contribuir para a epileptogênese, também tem um papel importante nos distúrbios de ansiedade que surgem como co-morbidade na epilepsia (Vazquez e Devinsky, 2003; Perini e Mendius, 1984; Altshuler et al, 1990).
Descobertas recentes mostram que o transplante de células precursoras neurais, oriundas da eminência gangliônica medial (EGM), possuem uma capacidade de migração e diferenciação em interneurônios inibitórios no parênquima cortical do hospedeiro (Álvarez-Dolado et al., 2006). Portanto esse projeto tem como objetivo avaliar o efeito do transplante de precursores interneuronais nos processos epileptogênicos e comportamentos associados a ele.
Descobertas recentes mostram que o transplante de células precursoras neurais, oriundas da eminência gangliônica medial (EGM), possuem uma capacidade de migração e diferenciação em interneurônios inibitórios no parênquima cortical do hospedeiro (Álvarez-Dolado et al., 2006). Portanto esse projeto tem como objetivo avaliar o efeito do transplante de precursores interneuronais nos processos epileptogênicos e comportamentos associados a ele.
Pesquisador: Bruno Dallagiovanna Muñiz/ Instituto: FIOCRUZ - RJ
Mecanismos da regulação pós-transcricionais da auto-renovação em células-tronco mesenquimais humanas? Análise funcional das proteínas pumilio2 e dzip1
O alvo do transplante celular é repopular um tecido ou órgão doente com um novo pool de células que poderiam restaurar a função perdida. As células tronco mesenquimais (CTMs) são células tronco adultas multipotentes e tem emergido como opção para uso na medicina regenerativa. A disponibilidade das CTMs serem adquiridas de certos tecidos de doadores, a facilidade de expansão em cultura, o isolamento simples via aderência ao plástico, a baixa taxa de rejeição e sua multipotencialidade para diferenciação faz das CTMs o ideal para aplicações clínicas. Estudos recentes indicam que a expansão in vitro dessas células é limitada. As CTMs senescem e perdem o seu potencial de diferenciação com o aumento do tempo e passagens da cultura num processo chamado de “envelhecimento in vitro”, sendo esta uma limitante importante para sua utilização em terapia celular.
Uma propriedade funcional central de todos os tipos de células tronco é sua capacidade de auto-renovação, onde a célula-tronco se divide assimetricamente para produzir células filhas com diferentes destinos. Fatores intracelulares e extracelulares controlam mecanismos que direcionam a célula filha a se auto-renovar ou comissionar-se a uma diferenciação. Os mecanismos que regulam em nível gênico a conservação da auto-renovação não são bem conhecidos. Os poucos estudos existentes focam a análise nos mecanismos de regulação do inicio da transcrição. Porém, os resultados observados tanto analisando genes individualmente como padrões de transcritoma destacam a importância da regulação pós-transcricional dos genes envolvidos na auto-renovação.
Os mecanismos de regulação pós-transcricional são intermediados por proteínas de união ao RNA, as quais se ligam preferentemente a elementos em cis presentes nas regiões não traduzidas dos mRNAs. Desta forma regulam a vida media dos transcritos e quais deles serão finalmente traduzidos em proteína. As redes de proteínas formada pelas proteínas Pumilio2 e DZIP1 estão envolvidas na auto-renovação de CT embrionárias e germinativas de diversos organismos, incluindo humanos o que sugere a sua participação nos mecanismos de auto-renovação em CTMs. Os mecanismos que regulam em nível gênico a conservação da auto-renovação não são bem conhecidos.
Neste contexto, pretendemos analisar os mecanismos moleculares envolvidos com o processo de diferenciação e auto-renovação de CTMs em nível pós-transcricional e o envolvimento das proteínas PUM2 e DZIP1 nos mesmos. Por RT-PCR, foi observada a expressão de RNAm de PUM2 e DZIP1 em CTM derivadas de medula óssea, sangue de cordão umbilical e tecido adiposo. Pretendemos realizar ensaios de curso temporal durante a diferenciação de CTMs originarias de tecido adiposo durante a adipogênese determinando a expressão dos transcritos e das proteínas DZIP1 e PUM2. O padrão de expressão durante a diferenciação permitirá inferir o processo biológico em que estão envolvidas. Ensaios de localização dos mRNAs por FISH informaram se as modificações observadas são um fenômeno geral o restrito a uma subpopulação das CTMs em diferenciação. A localização celular das proteínas estudadas depende do estado de ativação (diferenciação) das células-tronco. Para entender o estado inicial das CTMs realizaremos ensaios de imunofluorescência de DZIP1 e PUM2 em CTMs.
De forma a entender quais vias metabólicas ou de sinalização são reguladas pelas proteínas em estudo é fundamental identificar os mRNA alvos. Realizaremos ensaios de imunoprecipitação dos complexos de Ribonucleoproteínas (RNPs) formados por DZIP1 e PUM2 e após purificação dos mRNAs associados os identificaremos por hibridação em microarranjo de DNA humanos. Previamente, o ajuste das condições técnicas deste ensaio será feito em células HeLa. Identificando os mRNAs alvo das proteínas PUM2 e DZIP1 poderemos caracterizar as redes gênicas e concomitantemente as vias metabólicas fundamentais para a manutenção do estado primitivo. Estes resultados serão confirmados por EMSA e caracterizaremos as constantes cinéticas da interação entre as proteínas e os transcritos regulados por elas.
Finalmente a importância das proteínas estudadas na manutenção dos mecanismos de manutenção do estado primitivo será analisada realizando ensaios de “knock-down” gênico utilizando a técnica de interferência de RNA. Utilizaremos vetores lentivirais comerciais expressando pequenos RNAs complementares a seqüências de ambos genes. Obtido o fenótipo negativo analisaremos o potencial de diferenciação das células e a expressão dos mRNAs alvos identificados anteriormente.
O conhecimento das redes de regulação permitira identificar fatores e sinais indutores e repressores dos mecanismos de diferenciação celular. Além de fornecer dados importantes para entender os processos biológicos fundamentais que regulam o estado primitivo das CTMs, podemos tentar achar alternativas que permitam contornar os efeitos adversos da senescência e a perda da capacidade de diferenciação in vitro das células-tronco mesenquimais.
Uma propriedade funcional central de todos os tipos de células tronco é sua capacidade de auto-renovação, onde a célula-tronco se divide assimetricamente para produzir células filhas com diferentes destinos. Fatores intracelulares e extracelulares controlam mecanismos que direcionam a célula filha a se auto-renovar ou comissionar-se a uma diferenciação. Os mecanismos que regulam em nível gênico a conservação da auto-renovação não são bem conhecidos. Os poucos estudos existentes focam a análise nos mecanismos de regulação do inicio da transcrição. Porém, os resultados observados tanto analisando genes individualmente como padrões de transcritoma destacam a importância da regulação pós-transcricional dos genes envolvidos na auto-renovação.
Os mecanismos de regulação pós-transcricional são intermediados por proteínas de união ao RNA, as quais se ligam preferentemente a elementos em cis presentes nas regiões não traduzidas dos mRNAs. Desta forma regulam a vida media dos transcritos e quais deles serão finalmente traduzidos em proteína. As redes de proteínas formada pelas proteínas Pumilio2 e DZIP1 estão envolvidas na auto-renovação de CT embrionárias e germinativas de diversos organismos, incluindo humanos o que sugere a sua participação nos mecanismos de auto-renovação em CTMs. Os mecanismos que regulam em nível gênico a conservação da auto-renovação não são bem conhecidos.
Neste contexto, pretendemos analisar os mecanismos moleculares envolvidos com o processo de diferenciação e auto-renovação de CTMs em nível pós-transcricional e o envolvimento das proteínas PUM2 e DZIP1 nos mesmos. Por RT-PCR, foi observada a expressão de RNAm de PUM2 e DZIP1 em CTM derivadas de medula óssea, sangue de cordão umbilical e tecido adiposo. Pretendemos realizar ensaios de curso temporal durante a diferenciação de CTMs originarias de tecido adiposo durante a adipogênese determinando a expressão dos transcritos e das proteínas DZIP1 e PUM2. O padrão de expressão durante a diferenciação permitirá inferir o processo biológico em que estão envolvidas. Ensaios de localização dos mRNAs por FISH informaram se as modificações observadas são um fenômeno geral o restrito a uma subpopulação das CTMs em diferenciação. A localização celular das proteínas estudadas depende do estado de ativação (diferenciação) das células-tronco. Para entender o estado inicial das CTMs realizaremos ensaios de imunofluorescência de DZIP1 e PUM2 em CTMs.
De forma a entender quais vias metabólicas ou de sinalização são reguladas pelas proteínas em estudo é fundamental identificar os mRNA alvos. Realizaremos ensaios de imunoprecipitação dos complexos de Ribonucleoproteínas (RNPs) formados por DZIP1 e PUM2 e após purificação dos mRNAs associados os identificaremos por hibridação em microarranjo de DNA humanos. Previamente, o ajuste das condições técnicas deste ensaio será feito em células HeLa. Identificando os mRNAs alvo das proteínas PUM2 e DZIP1 poderemos caracterizar as redes gênicas e concomitantemente as vias metabólicas fundamentais para a manutenção do estado primitivo. Estes resultados serão confirmados por EMSA e caracterizaremos as constantes cinéticas da interação entre as proteínas e os transcritos regulados por elas.
Finalmente a importância das proteínas estudadas na manutenção dos mecanismos de manutenção do estado primitivo será analisada realizando ensaios de “knock-down” gênico utilizando a técnica de interferência de RNA. Utilizaremos vetores lentivirais comerciais expressando pequenos RNAs complementares a seqüências de ambos genes. Obtido o fenótipo negativo analisaremos o potencial de diferenciação das células e a expressão dos mRNAs alvos identificados anteriormente.
O conhecimento das redes de regulação permitira identificar fatores e sinais indutores e repressores dos mecanismos de diferenciação celular. Além de fornecer dados importantes para entender os processos biológicos fundamentais que regulam o estado primitivo das CTMs, podemos tentar achar alternativas que permitam contornar os efeitos adversos da senescência e a perda da capacidade de diferenciação in vitro das células-tronco mesenquimais.
Pesquisador: Carlos Alexandre Netto / Instituto: UFRGS - RS
Uso de células-tronco mesenquimais humanas de cordão umbilical e de liquido amniótico na regeneração funcional da lesão de medula espinhal e na hipoxia-isquemia cerebral neonatal em ratos
A medicina regenerativa é a grande inovação desse século. O estudo de células-tronco (CT) vem quebrando paradigmas, mostrando-se ser o futuro da terapia regenerativa de órgãos e tecidos. O presente projeto de pesquisa enquadra-se como pesquisa pré-clínica onde células-tronco mesenquimais de duas diferentes fontes serão utilizadas em modelos animais com lesão de medula espinhal e na hipóxia-isquemia cerebral neonatal. Células da parede da veia umbilical e do líquido amniótico serão cultivadas para obtenção das células-tronco mesenquimais, as quais têm sido consideradas pluripotentes, ou seja, capazes de originar diversos tecidos do corpo humano.
Essas células serão isoladas, cultivadas e bem caracterizadas pelos critérios estabelecidos pela literatura que permitem caracterizá-las como CTM, os quais são: proliferação como células aderentes, imunofenótipo e capacidade de diferenciação in vitro. Os mecanismos moleculares de manutenção de estado primitivo das CT serão avaliados, através da análise por RT-PCR para OCt4, marcador de estado embrionário. Além disso, a cariotipagem será realizada nos cultivos celulares e os mecanismos celulares serão avaliados por citometria de fluxo. Sua indução à diferenciação celular será avaliada através da diferenciação em osteoblastos e adipócitos. Dessa forma, células-tronco bem caracterizadas serão utilizadas nos dois modelos animais de lesões neurológicas, onde serão estudadas a janela de aplicação pós-lesão e a via de administração das células, bem como a avaliação morfológica, funcional, motora e cognitiva.
Essas células serão isoladas, cultivadas e bem caracterizadas pelos critérios estabelecidos pela literatura que permitem caracterizá-las como CTM, os quais são: proliferação como células aderentes, imunofenótipo e capacidade de diferenciação in vitro. Os mecanismos moleculares de manutenção de estado primitivo das CT serão avaliados, através da análise por RT-PCR para OCt4, marcador de estado embrionário. Além disso, a cariotipagem será realizada nos cultivos celulares e os mecanismos celulares serão avaliados por citometria de fluxo. Sua indução à diferenciação celular será avaliada através da diferenciação em osteoblastos e adipócitos. Dessa forma, células-tronco bem caracterizadas serão utilizadas nos dois modelos animais de lesões neurológicas, onde serão estudadas a janela de aplicação pós-lesão e a via de administração das células, bem como a avaliação morfológica, funcional, motora e cognitiva.
Pesquisador: Cristina Ribeiro de Barros Cardoso/ Instituto: UFTM - MG
Potencial terapêutico de células mesenquimais estromais na doença inflamatória intestinal
As Doenças Inflamatórias Intestinais (DII), como a doença de Crohn e a colite ulcerativa, são caracterizadas por inflamação crônica descontrolada da mucosa intestinal. Enquanto a colite ulcerativa é caracterizada por resposta imune Th2, pacientes com doença de Crohn apresentam resposta Th1 e, recentemente, descobriu-se a presença de células Th17, com produção das citocinas IL-17 e IL-23 na mucosa inflamada. Por outro lado, as subpopulações de células T reguladoras apresentam papel crítico no controle de respostas auto-imunes e/ou exageradas, como nas DII. Embora as terapias atuais sejam direcionadas a estes elementos da cascata imuno-inflamatória, nenhum tratamento é, no momento, totalmente efetivo, sendo evidente a necessidade de novas terapias para o controle da progressão das DII.
As células mesenquimais estromais (MSCs) são células multipotentes de medula óssea, com grande capacidade imunossupressora e reguladora, com importantes perspectivas terapêuticas para o tratamento de doenças auto-imunes e inflamatórias. Sendo assim, este estudo pré-clínico visa avaliar o potencial terapêutico de MSCs humanas na DII induzida experimentalmente. As MSCs serão isoladas e cultivadas a partir de células mononucleares de medula óssea de doadores saudáveis. A DII será induzida em camundongos Balb/c com injeção intra-retal de ácido trinitrobenzeno sulfônico (TNBS) e, após indução da doença, fenotipagem e marcação das MSCs, os animais serão tratados com as células e sacrificados nos dias 7, 14 e 60 pós-transplante, para a coleta de segmentos intestinais e linfonodos mesentéricos. Serão avaliados o peso, presença de diarréia e, por histopatologia, a resposta inflamatória intestinal de camundongos com DII antes e após o tratamento com MSC. A modulação da resposta imune intestinal será avaliada com ênfase nas subpopulações de células T reguladoras e Th17.
Além destas, as células do infiltrado inflamatório (CD3, CD4, CD8, CD11b, CD11c, NK, NKT, gama-delta) no intestino e linfonodos serão avaliadas por citometria de fluxo, imunohistoquímica e microscopia confocal. A expressão dos fatores de transcrição ROR, Foxp3 e das citocinas IL-10, TGF-beta, IL-4, IFN-gama, TNF-alfa, IL-6, IL-17, IL-21, IL-23, IL-25 e IL-27 será avaliada por PCR em tempo real e/ou ELISA. Ainda, o potencial supressor das células T reguladoras antes e após a terapia com MSCs será avaliado em ensaios de co-cultura com células efetoras, assim como a capacidade proliferativa de linfócitos T efetores de animais com DII frente às MSCs.
A presença, no intestino, da população de MSC infundidas, será avaliada por imunohistoquímica/confocal e a ocorrência de fusão celular entre as MSC humanas e células intestinais murinas por FISH. Amostras de outros órgãos serão também coletadas com o intuito de se averiguar possíveis alterações e a migração de MSCs para outros tecidos além daqueles inflamados, por meio da marcação das MSC (Qtracker) previamente à infusão. Finalmente, os resultados obtidos contribuirão para o entendimento da patogênese das DII e para demonstração da eficácia das MSC no tratamento dessas doenças, bem como os mecanismos imunológicos envolvidos. Sendo assim, este projeto visa proporcionar bases científicas para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o tratamento da colite ulcerativa e/ou doença de Crohn.
As células mesenquimais estromais (MSCs) são células multipotentes de medula óssea, com grande capacidade imunossupressora e reguladora, com importantes perspectivas terapêuticas para o tratamento de doenças auto-imunes e inflamatórias. Sendo assim, este estudo pré-clínico visa avaliar o potencial terapêutico de MSCs humanas na DII induzida experimentalmente. As MSCs serão isoladas e cultivadas a partir de células mononucleares de medula óssea de doadores saudáveis. A DII será induzida em camundongos Balb/c com injeção intra-retal de ácido trinitrobenzeno sulfônico (TNBS) e, após indução da doença, fenotipagem e marcação das MSCs, os animais serão tratados com as células e sacrificados nos dias 7, 14 e 60 pós-transplante, para a coleta de segmentos intestinais e linfonodos mesentéricos. Serão avaliados o peso, presença de diarréia e, por histopatologia, a resposta inflamatória intestinal de camundongos com DII antes e após o tratamento com MSC. A modulação da resposta imune intestinal será avaliada com ênfase nas subpopulações de células T reguladoras e Th17.
Além destas, as células do infiltrado inflamatório (CD3, CD4, CD8, CD11b, CD11c, NK, NKT, gama-delta) no intestino e linfonodos serão avaliadas por citometria de fluxo, imunohistoquímica e microscopia confocal. A expressão dos fatores de transcrição ROR, Foxp3 e das citocinas IL-10, TGF-beta, IL-4, IFN-gama, TNF-alfa, IL-6, IL-17, IL-21, IL-23, IL-25 e IL-27 será avaliada por PCR em tempo real e/ou ELISA. Ainda, o potencial supressor das células T reguladoras antes e após a terapia com MSCs será avaliado em ensaios de co-cultura com células efetoras, assim como a capacidade proliferativa de linfócitos T efetores de animais com DII frente às MSCs.
A presença, no intestino, da população de MSC infundidas, será avaliada por imunohistoquímica/confocal e a ocorrência de fusão celular entre as MSC humanas e células intestinais murinas por FISH. Amostras de outros órgãos serão também coletadas com o intuito de se averiguar possíveis alterações e a migração de MSCs para outros tecidos além daqueles inflamados, por meio da marcação das MSC (Qtracker) previamente à infusão. Finalmente, os resultados obtidos contribuirão para o entendimento da patogênese das DII e para demonstração da eficácia das MSC no tratamento dessas doenças, bem como os mecanismos imunológicos envolvidos. Sendo assim, este projeto visa proporcionar bases científicas para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o tratamento da colite ulcerativa e/ou doença de Crohn.
Pesquisador: Dimas Tadeu Covas/ Instituto: USP - SP
Geração de células tronco pluripotentes induzidas (iPS) humanas utilizando vetores lentivirais e adenovirais
Linhagens de células-tronco embrionárias (CTEs) humanas derivadas da massa celular interna de blastocistos são pluripotentes e, além de possuírem um grande potencial terapêutico como fonte de tecidos para transplantes, são uma importante ferramenta para pesquisa básica voltada ao estudo da diferenciação celular e desenvolvimento embrionário humano, entre outros. Apesar de em modelos animais já ter sido demonstrado o efeito terapêutico das CTEs em diferentes doenças, o uso clínico destas células em seres-humanos ainda não foi relatado. Questões relacionadas à imunocompatibilidade entre os tecidos derivados das CTEs e o paciente, entre outras, ainda precisam ser resolvidas antes que estas possam ser utilizadas em testes clínicos.
Recentemente, dois grupos relataram a indução de pluripotência em fibroblastos primários humanos através da transdução dos mesmos com vetores virais expressando diferentes conjuntos de 4 fatores de transcrição (FT): OCT4, NANOG, LIM28 e SOX2; ou OCT4, C-MYC, KLF4 e SOX2. As chamadas células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) têm morfologia característica de CTEs, expressam marcadores de células pluripotentes e são capazes de se diferenciar in vitro e in vivo em tecidos derivados dos três folhetos embrionários. Apesar de ainda inadequadas para uso clínico, as iPS são uma ferramenta importante de pesquisa básica, principalmente aquelas células derivadas de indivíduos com diferentes doenças genéticas.
Neste projeto, pretendemos desenvolver novos vetores de reprogramação (lentivirais e adenovirais) para serem usados na reprogramação de células-tronco mesenquimais (CTM) e progenitoras endoteliais. CTM e progenitores endoteliais derivadas da medula óssea humana são considerados as células-tronco mais promissoras para a terapia celular devido a sua capacidade de expansão in vitro e ao seu potencial de diferenciação. No entanto, estas células estão limitadas a se diferenciar em células apenas de origem mesodérmica e após sucessivas passagens tornam-se senescentes. A adição dos FT relacionados a pluripotência pode transformar estas células multipotentes em pluripotentes e com capacidade de expansão in vitro ilimitada.
Na primeira fase do projeto vamos utilizar vetores lentivirais, devido a extensa experiência do grupo com estes vetores, para padronizar os ensaios de transdução, analisar os efeitos dos FT nas células-tronco mesenquimais e nas progenitoras endoteliais e, determinar qual o grupo de FT são necessários para gerar iPS nas linhagens citas. Na segunda fase, serão escolhidos os FT indispensáveis para geração de iPS que serão clonados em vetores adenovirais para gerar iPS não geneticamente modificadas que poderão ser utilizadas em ensaios clínicos.
Recentemente, dois grupos relataram a indução de pluripotência em fibroblastos primários humanos através da transdução dos mesmos com vetores virais expressando diferentes conjuntos de 4 fatores de transcrição (FT): OCT4, NANOG, LIM28 e SOX2; ou OCT4, C-MYC, KLF4 e SOX2. As chamadas células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) têm morfologia característica de CTEs, expressam marcadores de células pluripotentes e são capazes de se diferenciar in vitro e in vivo em tecidos derivados dos três folhetos embrionários. Apesar de ainda inadequadas para uso clínico, as iPS são uma ferramenta importante de pesquisa básica, principalmente aquelas células derivadas de indivíduos com diferentes doenças genéticas.
Neste projeto, pretendemos desenvolver novos vetores de reprogramação (lentivirais e adenovirais) para serem usados na reprogramação de células-tronco mesenquimais (CTM) e progenitoras endoteliais. CTM e progenitores endoteliais derivadas da medula óssea humana são considerados as células-tronco mais promissoras para a terapia celular devido a sua capacidade de expansão in vitro e ao seu potencial de diferenciação. No entanto, estas células estão limitadas a se diferenciar em células apenas de origem mesodérmica e após sucessivas passagens tornam-se senescentes. A adição dos FT relacionados a pluripotência pode transformar estas células multipotentes em pluripotentes e com capacidade de expansão in vitro ilimitada.
Na primeira fase do projeto vamos utilizar vetores lentivirais, devido a extensa experiência do grupo com estes vetores, para padronizar os ensaios de transdução, analisar os efeitos dos FT nas células-tronco mesenquimais e nas progenitoras endoteliais e, determinar qual o grupo de FT são necessários para gerar iPS nas linhagens citas. Na segunda fase, serão escolhidos os FT indispensáveis para geração de iPS que serão clonados em vetores adenovirais para gerar iPS não geneticamente modificadas que poderão ser utilizadas em ensaios clínicos.
Pesquisador: Emerson Leandro Gasparetto/ Instituto: UFRJ - RJ
Marcação de células-tronco com nanopartículas superparamagnéticas para avaliar a migração e integração destas em modelos animais de terapias celulares
Células-tronco vêm sendo utilizadas em uma série de modelos animais de doenças e lesões do sistema nervoso central com resultados promissores e também em alguns estudos clínicos. Um dos problemas nestas terapias é a dificuldade em avaliar a migração destas células para as áreas de injúria assim como verificar a sua possível integração com o tecido hospedeiro e sua possível diferenciação. Neste projeto avaliaremos a possibilidade de marcar células-tronco pluripotentes (embrionárias, induzidas e neurais) e células-tronco adultas (fração mononuclear e células mesenquimais derivadas da medula óssea e do sangue do cordão umbilical) com nanopartículas superparamagneticas de óxido de ferro (Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles - SPION). Esta marcação permite o acompanhamento dinâmico das células dentro do organismo receptor por ressonância magnética nuclear (RM), técnica de imagem hoje disponível em hospitais e centros de pesquisa médica. Apesar das propriedades magnéticas dos íons ferro serem fundamentais para a observação por RM, é necessário também revestir estas nanopartículas com substâncias que facilitem a permeação celular e a absorção destas nanopartículas pelas células alvo. Um exemplo é o recobrimento com dextran, um polissacarídeo, e estas partículas revestidas já vêm sendo empregadas rotineiramente em exames por RM, sendo disponíveis com diversos nomes comerciais como, por exemplo, Feridex®. As partículas disponíveis comercialmente, no entanto, foram desenhadas para marcar células fagocíticas uma vez que são capturadas rapidamente por macrófagos, monócitos e células de Kupfer por exemplo. As células-tronco no entanto não são fagocíticas e protocolos de marcação tem que ser desenvolvidos para promover a marcação destas células com nanopartículas sem alterar as propriedades biológicas e terapêuticas das mesmas.
Nossa proposta é preparar SPIONs revestidas com diferentes materiais, de forma a permitir uma maior permeabilidade pela membrana celular, como protamina e outros polipeptídeos catiônicos. Além disto, pretendemos desenvolver SPIONs revestidas por uma monocamada de sílica funcionalizada, de forma a permitir a fixação de ligantes específicos para proteínas receptoras presentes em linhagens celulares definidas. Esta metodologia nos permitirá obter uma seletividade na marcação de sub-populações de células para terapias celulares como, por exemplo, a população de precursores endotelias dentro da fração mononuclear e ou a sub-população de células mesenquimais. Com esta metodologia poderemos marcar populações especificas para terapias para o infarto de miocárdio ou para o acidente vascular cerebral, ou ainda para mapear a presença de neurônios colinérgicos no SNC e acompanhar a evolução do seu desaparecimento em doenças neurodegenerativas, como o Mal de Alzheimer. Estas células marcadas serão injetadas em diferentes modelos de doenças neurológicas e a migração e integração das células marcadas para as áreas de degeneração tecidual serão avaliados por métodos histoquímicos, imunohistoquímicos e por imagem. Uma vez estabelecidos os protocolos de marcação de células-tronco estas poderão vir a ser utilizadas pelos diferentes grupos trabalhando com terapias celulares em vários modelos animais. Uma vez que a segurança e eficácia destas células marcadas seja demonstrada em modelos animais será possível estender seu uso para estudos clínicos de terapias celulares.
Nossa proposta é preparar SPIONs revestidas com diferentes materiais, de forma a permitir uma maior permeabilidade pela membrana celular, como protamina e outros polipeptídeos catiônicos. Além disto, pretendemos desenvolver SPIONs revestidas por uma monocamada de sílica funcionalizada, de forma a permitir a fixação de ligantes específicos para proteínas receptoras presentes em linhagens celulares definidas. Esta metodologia nos permitirá obter uma seletividade na marcação de sub-populações de células para terapias celulares como, por exemplo, a população de precursores endotelias dentro da fração mononuclear e ou a sub-população de células mesenquimais. Com esta metodologia poderemos marcar populações especificas para terapias para o infarto de miocárdio ou para o acidente vascular cerebral, ou ainda para mapear a presença de neurônios colinérgicos no SNC e acompanhar a evolução do seu desaparecimento em doenças neurodegenerativas, como o Mal de Alzheimer. Estas células marcadas serão injetadas em diferentes modelos de doenças neurológicas e a migração e integração das células marcadas para as áreas de degeneração tecidual serão avaliados por métodos histoquímicos, imunohistoquímicos e por imagem. Uma vez estabelecidos os protocolos de marcação de células-tronco estas poderão vir a ser utilizadas pelos diferentes grupos trabalhando com terapias celulares em vários modelos animais. Uma vez que a segurança e eficácia destas células marcadas seja demonstrada em modelos animais será possível estender seu uso para estudos clínicos de terapias celulares.
Pesquisador: Geraldo Aleixo da Silva Passos Junior/ Instituto: USP/Ribeirão Preto - SP
Análise da expressão de grupos de genes sintênicos durante a diferenciação osteoblástica de células tronco mesenquimais adultas humanas e murinas
Estudos recentes indicam que células mesenquimais provenientes de tecidos específicos são capazes de se diferenciarem em células de outros tecidos, oferecendo assim a perspectiva de novas estratégias terapêuticas para o reparo de tecidos lesados. O potencial terapêutico das células tronco já é uma realidade, mas muitos aspectos da biologia molecular da proliferação e da diferenciação destas células ainda permanecem desconhecidos. Ainda não conhecemos todos os genes implicados no processo de diferenciação dessas células. Para atingirmos esse conhecimento precisamos utilizar ferramentas da genômica funcional e mensurarmos a expressão diferencial de genes em grande escala durante a diferenciação, realizando assim a análise do transcriptoma.
A tecnologia dos DNA microarrays é consagrada na área de análise da expressão gênica em grande escala, sendo largamente aplicada em biologia e medicina na aquisição de novos conhecimentos básicos e também na área diagnóstica. Com os DNA microarrays e aplicando métodos matemático-estatísticos específicos, podemos mensurar a expressão de milhares de genes num único experimento. Por isso os microarrays tornaram-se o método de escolha na exploração do transcriptoma em diversas situações normais e patológicas.
Comparações genômicas entre espécies é muito importante. Sintenia é o termo usado para conceituar a conservação inter-espécies da ordem dos genes ao longo dos cromossomos e cuja homologia de seqüência entre esses genes também importa. Estudos sobre a sintenia homem-camundongo representam grande interesse, pois contribuem com a pesquisa sobre a coincidência dos eventos genético-moleculares que ocorrem nas células humanas e no sistema-modelo murino. Como há dificuldade óbvia na obtenção de células tronco mesenquimais de medula óssea humana para a pesquisa básica, o sistema-modelo murino passa a ser de grande interesse.
É importante ressaltar que estudos comparativos sobre osteogênese, marcadores do fenótipo osteoblástico e perfil de expressão gênica usando DNA microarrays de células tronco, oriundas de medula óssea murina e de medula óssea humana, antes e após serem diferenciadas em osteoblastos são originais, assim como a análise sintênica do perfil de expressão gênica são ainda necessários. Não existem dados na literatura sobre este tipo de comparação e consideramos ser importante realizarmos esses estudos, pois poderemos estabelecer os parâmetros genético-moleculares que poderão ser mais bem estudados utilizando células murinas ao invés das humanas por razões óbvias.
A tecnologia dos DNA microarrays é consagrada na área de análise da expressão gênica em grande escala, sendo largamente aplicada em biologia e medicina na aquisição de novos conhecimentos básicos e também na área diagnóstica. Com os DNA microarrays e aplicando métodos matemático-estatísticos específicos, podemos mensurar a expressão de milhares de genes num único experimento. Por isso os microarrays tornaram-se o método de escolha na exploração do transcriptoma em diversas situações normais e patológicas.
Comparações genômicas entre espécies é muito importante. Sintenia é o termo usado para conceituar a conservação inter-espécies da ordem dos genes ao longo dos cromossomos e cuja homologia de seqüência entre esses genes também importa. Estudos sobre a sintenia homem-camundongo representam grande interesse, pois contribuem com a pesquisa sobre a coincidência dos eventos genético-moleculares que ocorrem nas células humanas e no sistema-modelo murino. Como há dificuldade óbvia na obtenção de células tronco mesenquimais de medula óssea humana para a pesquisa básica, o sistema-modelo murino passa a ser de grande interesse.
É importante ressaltar que estudos comparativos sobre osteogênese, marcadores do fenótipo osteoblástico e perfil de expressão gênica usando DNA microarrays de células tronco, oriundas de medula óssea murina e de medula óssea humana, antes e após serem diferenciadas em osteoblastos são originais, assim como a análise sintênica do perfil de expressão gênica são ainda necessários. Não existem dados na literatura sobre este tipo de comparação e consideramos ser importante realizarmos esses estudos, pois poderemos estabelecer os parâmetros genético-moleculares que poderão ser mais bem estudados utilizando células murinas ao invés das humanas por razões óbvias.
Pesquisador: Helena Paula Brentani/ Instituto: FAP-SP
Análise comparativa dos mecanismos de neurogênese de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) geradas a partir de queratinócitos de pacientes esquizofrênicos e normais
Esquizofrenia é uma doença mental que causa alterações no processo dos pensamentos, percepções e emoções e leva normalmente a uma deterioração e embotamento afetivo. Estudos de adoção, gêmeos, associação e ligação já mostraram que existe um forte componente genético na esquizofrenia. A heterogeneidade e complexidade dos quadros fenotípicos tem desafiado estudos de ligação. Estudos recentes têm trazido evidência replicada de que pacientes portadores de esquizofrenia apresentam um aumento de variações estruturais ao longo do seu genoma. Assim podemos categorizar esquizofrenia, assim como autismo e outros retardos mentais, como doenças genômicas de neurodesenvolvimento. Células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) são obtidas pela reprogramação de células adultas da pele. Por serem geneticamente idênticas ao doador, e capazes de gerar todos os tipos celulares de um indivíduo inclusive neurônios, poderão auxiliar na caracterização de alterações no desenvolvimento do sistema nervoso associadas a patologias específicas e de difícil etiologia como é o caso da esquizofrenia.
Este projeto tem como proposta estudar possíveis alterações de expressão gênica e características fenotípicas de neurônios produzidos a partir de iPS geradas pela reprogramação de queratinócitos provenientes de pacientes esquizofrênicos com história familiar bem caracterizada, comparados a iPS de indivíduos normais.
A proposta é inovadora, inédita e possui aplicabilidade e relevância para o desenvolvimento científico, tecnológico e clínico de nosso país.
Este projeto tem como proposta estudar possíveis alterações de expressão gênica e características fenotípicas de neurônios produzidos a partir de iPS geradas pela reprogramação de queratinócitos provenientes de pacientes esquizofrênicos com história familiar bem caracterizada, comparados a iPS de indivíduos normais.
A proposta é inovadora, inédita e possui aplicabilidade e relevância para o desenvolvimento científico, tecnológico e clínico de nosso país.
Pesquisador: Ilka Boin / Instituto: Unicamp - SP
Avaliação da capacidade de células tronco mesenquimais obtidas de tecido adiposo, sangue de cordão umbilical e de medula óssea humanos em se diferenciar em hepatócitos.
Cirrose hepática é uma síndrome resultante da perda de massa celular com correspondente diminuição de sua função, abaixo do nível crítico. A utilização de terapia celular, na tentativa de diferenciação de células tronco para hepatócitos, proporcionando regeneração do tecido hepático nestes pacientes, poderia melhorar o quadro clínico dos pacientes, enquanto aguardariam na fila do transplante de fígado ou em futuro próximo evitar o próprio transplante. O Objetivo deste estudo é avaliar a capacidade das células mesenquimais obtidas de tecido adiposo (TA), sangue de cordão umbilical (SCU) e de medula óssea (MO),humanos em se diferenciarem em hepatócitos. Verificar se as células mesenquimais indiferenciadas e diferenciadas obtidas das três fontes teriam capacidade de regenerar parênquima hepático de camundongos SCID submetidos à hepatite fulminante. Comparar a efetividade das fontes de obtenção de células mesenquimais no processo de diferenciação para a linhagem hepática.
Material e método: TA será obtida de procedimentos de lipoaspiração realizado no Hospital de Clínicas, o sangue de cordão de unidades coletadas pelo Banco Público de Sangue de Cordão e a medula óssea das doações realizadas para a Unidade de Transplante de Medula. Todos os serviços pertencem à UNICAMP. TA será submetida à digestão por colagenase, SCU E MO à gradiente de Ficoll –hipaque. As células de gordura e as mononucleares de SCU e MO serão cultivadas em DMEM low glicose com SBF durante 3 dias. Ao alcançarem 70-80% de confluência, as células aderentes serão tratadas com tripsina e cultivadas novamente no meio citado, primeira passagem. Na quarta passagem as células serão caracterizadas através de morfologia, citometria de fluxo, microscopia confocal e diferenciação para a linhagem mesodérmica, para confirmar a diferenciação para células tronco mesenquimais (MSCs). A Análise de expressão da atividade da enzima telomerase e de cariótipo também serão realizadas para avaliar tumorigenicidade das células. As MSCs obtidas das três fontes, após caracterização na quarta passagem, serão submetidas ao protocolo de diferenciação para hepatócitos em 3 fases; na fase 0 serão semeadas em discos de cultura contendo colágeno tipo I com o meio já citado. Ao atingirem confluência serão submetidas à privação de soro por 2 dias, na presença de 20ng/mL de EGF e 10ng/mL bFGF. Fase 1, as células serão submetidas ao meio de diferenciação que consiste em 20ng/mL de HGF; 10ng/mL de bFGF, 0.61g/L de nicotinamida por 7 dias. Fase 2, meio de maturação, 20ng/mL de oncostatin humano 1µmol/L de dexametasona e 50mg/mL de ITS premix por 36 dias. A diferenciação para linhagem hepatocítica será avaliada através de microscopia óptica para avaliar a mudança de morfologia das células, análise funcional através da detecção de depósitos de glicogênio, coloração de PAS, da absorção do corante ICG. A análise da expressão gênica através de RTPCR dos genes da albumina, Alpha- fetoproteina (AF), tirosina amino transferase (TAT) e glutamina sintetase (GS) será também realizada nos dias 9, 18, 25 e 36 de cultura. O experimento animal para detectar a funcionalidade destas células na regeneração de hepatite fulminante, será realizado com camundongos Balbc/SCID, do sexo masculino, com idade entre 6-8 semanas, as células a serem transplantadas são de doadoras do sexo feminino.. Os animais serão submetidos à injeção intraperitoneal de 500 µg/kg peso de tetracloreto de carbono (CCL4), diluído em 100µL de azeite. Os animais serão sacrificados 24h, 48h, 7, 15 e 30 dias após a injeção do CCL4 e a morfologia dos cortes histológicosavaliada com coloração de HE. As MSCs obtidas das três fontes, indiferenciadas e diferenciadas, pré-marcadas com corante fluorescente, serão injetadas em veia caudal ou orbital, 48 horas após a injeção do CCL4. Os animais serão sacrificados para avaliação do fígado, nos 7, 15 e 30 dias pós- transplante. Os resultados do anatomopatplógico serão analisados através de microscopia óptica, coloração dos cortes histológicos com HE para morfologia e Massom para detecção de fibrose. O Homing e proliferação in situ serão avaliados por microscopia confocal e teste de FISH. A análise funcional será também realizada através da quantificação das enzimas hepáticas pré-injeção de CCL4, pós injeção, mas pré-transplante e nos dias 7, 15 e 30 pós transplante. A quantificação da albumina será também realizada nestes momentos.
Pesquisador: Jose Eduardo Krieger / Instituto: USP -SP
Reprogramação de células adultas de tecido adiposo em células-tronco pluripotentes e cardiomiócitos
A reprogramação bem sucedida de células somáticas humanas a um estado de pluripotência permitiria a criação de células tronco doença e doente especifica. Recentemente foi demonstrado que ao se introduzir pelo menos quatro fatores de transcrição (Sox2, Oct3/4, Klf4 e c-Myc) por transdução viral em células somáticas, essas são reprogramadas a um estado pluripotente muito semelhante às ES. Essas foram denominadas células-tronco pluripotentes induzidas (iPS). Em trabalhos subseqüentes, o mesmo grupo liderado por Yamanaka foi capaz de induzir a diferenciação dessas células em cardiomiócitos, e observou melhora na função cardíaca quando injetadas em modelo de infarto. Porém a eficiência desse processo de diferenciação é muito baixa, dificultando sua aplicação em humanos. Além disso, a utilização de vetores retrovirais torna esse procedimento de reduzida aplicação clínica, devido aos riscos de desenvolvimento de tumores por ativação de genes endógenos causada pela mutagênese insercional.
Para contornar esses problemas, nesse trabalho pretendemos 1. estabelecer cultura de células iPS a partir de fibroblastos de camundongos e humanos, de acordo com a técnica desenvolvida por Takahashi e Yamanaka; 2. testar a hipótese de que células iPS podem se transformar em cardiomiócitos eficientemente por meio da transdução de fatores de transcrição que induzem a cardiomiogênese; 3. testar a hipótese de que a ação de fatores de transcrição ligados a um sinal de secreção e ao peptídeo carreador TAT reprogramem células mesenquimais de tecido adiposo em células pluripotentes induzidas (iPS) para que não seja necessária a utilização de vírus no processo. Com isso, pretendemos obter cardiomiócitos específicos de maneira mais eficiente que poderão ser utilizados para reparação cardíaca biológica por meio de terapia celular a partir de células o próprio paciente.
Para contornar esses problemas, nesse trabalho pretendemos 1. estabelecer cultura de células iPS a partir de fibroblastos de camundongos e humanos, de acordo com a técnica desenvolvida por Takahashi e Yamanaka; 2. testar a hipótese de que células iPS podem se transformar em cardiomiócitos eficientemente por meio da transdução de fatores de transcrição que induzem a cardiomiogênese; 3. testar a hipótese de que a ação de fatores de transcrição ligados a um sinal de secreção e ao peptídeo carreador TAT reprogramem células mesenquimais de tecido adiposo em células pluripotentes induzidas (iPS) para que não seja necessária a utilização de vírus no processo. Com isso, pretendemos obter cardiomiócitos específicos de maneira mais eficiente que poderão ser utilizados para reparação cardíaca biológica por meio de terapia celular a partir de células o próprio paciente.
Pesquisador: Joyce Maria Annichino-Bizzacchi/ Instituto: UNICAMP-SP
Avaliação do uso de células-tronco humanas derivadas de tecido adiposo na neovascularização de membros isquêmicos de camundongos - estudo pré-clínico a terapia celular na Doença Arterial Periférica Crônica (DAPc)
Doença arterial periférica (PAD) é uma doença oclusiva arterial crônica de membros inferiores causada por aterosclerose. É uma das causas mais comuns de dor e incapacidade dos membros inferiores e devido ao negligenciamento de seu diagnóstico, a DAPc está associada a uma significativa morbidade e mortalidade. A terapia angiogênica com o uso de células tronco é uma alternativa terapêutica decorrente da plasticidade celular na promoção da neovascularização. O objetivo deste trabalho consiste em promover neovascularização em membros isquêmicos de modelos murino de DAPc, pelo uso de células tronco derivadas de tecido adiposo (ADSC), de doadores humano normais e avaliar sua eficiência para futuros tratamentos baseados em terapia celular. O uso de células tronco derivadas de tecido adiposo é um novo nicho promissor de obtenção de células tronco adultas. Pretende-se a validação de um modelo animal que mimetize adequadamente a DAPc humana, permitindo uma melhor avaliação da resposta à terapia celular. Esta terapia será avaliada pela associação dos métodos de perfusão relativa, densidade capilar, arteriogênese e permeabilidade capilar.
Pesquisador: Julio Cesar Voltarelli/ Instituto: USP-SP
Terapia do diabetes mellitus com células-tronco mesenquimais: avaliação da resposta clínica e investigação dos mecanismos de ação
O diabetes mellitus tipo 1 (DM-1) é uma doença auto-imune (DAI) inflamatória, mediada por células T auto-reativas e caracterizadas pela destruição seletiva de células beta pancreáticas produtoras de insulina. A suscetibilidade ao DM-1 é determinada por fatores genéticos, ambientais e mecanismos defectivos de imunoregulação. A doença clínica manifesta-se somente após destruição de aproximadamente 80-90% das células b pancreáticas. O processo destrutivo das células b leva à falta do hormônio insulina, que resulta num estado de hiperglicemia e suas conseqüências agudas e crônicas. Se não tratados, os distúrbios metabólicos levam progressivamente à depressão do sistema nervoso central, coma e morte. Assim, pacientes necessitam de tratamento permanente com insulina exógena para sobrevivência. Algumas complicações crônicas graves decorrentes da agressão auto-imune são os problemas vasculares que levam à insuficiência renal, cegueira, doença cardíaca e úlceras crônicas.
Por outro lado, o diabetes mellitus tipo 2 (DM-2) é uma doença metabólica associada basicamente a dois mecanismos, a resistência à ação da insulina e a disfunção secretória das células beta pancreáticas. Os mecanismos moleculares que determinam a deficiência secretória de insulina ou a sua ação deficiente não estão bem definidos e estão sendo objeto de intensa investigação nos últimos anos. Entretanto, há evidências abundantes da presença de um importante componente inflamatório envolvido na patogênese da resistência insulínica e da disfunção das células beta pancreáticas. A resistência insulínica, um dos principais fatores patogênicos do DM-2, está freqüentemente associada a outros fatores de risco cardiovascular, como hipertensão, obesidade e dislipidemia. Na última década, o DM-2, que representa 90-95% dos casos de diabetes, tornou-se um importante problema clínico e de saúde pública em todo o mundo. As complicações crônicas do DM-2, que se instalam em longo prazo, decorrem de alterações micro e macrovasculares que levam a disfunção, dano ou falência de vários órgãos. Todo esse quadro incorre em elevado custo econômico e social, comprometendo a produtividade, a qualidade de vida e a sobrevida da população.
O DM-1 é tratado pela terapia convencional com insulina ou terapia intensiva com insulina. Ensaios clínicos com imunossupressores, anticorpo monoclonal anti-CD3 e o transplante de ilhotas pancreáticas vêm sendo realizados com resultados significativos, mas insuficientes para aplicação clínica rotineira. Já, o tratamento do DM-2 envolve dieta, exercícios físicos, drogas orais e freqüentemente injeções diárias de insulina. Esse cenário estimula novas pesquisas acerca de alternativas terapêuticas para diabetes, tais como a diferenciação in vitro de células-tronco humanas em células β pancreáticas para transplante e tratamento do DM-1 com células-tronco adultas. Nesse contexto, as células-tronco mesenquimais (CTM) representam uma fonte de células-tronco adultas ideal para terapia celular em virtude de seu fácil isolamento, expansão in vitro e capacidade imunossupressora, imunoreguladora e regenerativa.
Trabalhos recentes demonstraram um efeito terapêutico satisfatório após infusões de CTM em modelos animais de DM-1 (na fase inicial da doença) e em pacientes com a doença do enxerto-versus-hospedeiro, doença cujos mecanismos imunológicos assemelham-se aos das DAI. Adicionalmente, há observações em estudos experimentais que sugerem efeitos benéficos do transplante de células-tronco totais da medula óssea sobre a hiperglicemia e suas complicações no DM-2. Nesse contexto, nossa hipótese é que o diabetes possa ser controlado através da infusão das CTM, pois uma vez infundidas nos pacientes diabéticos elas migram preferencialmente para o tecido pancreático inflamado, promovem imunossupressão local e estimulam os mecanismos de regeneração locais através de efeitos parácrinos, os quais envolvem a produção de moléculas anti-inflamatórias e imunoreguladoras e de fatores de crescimento e angiogênicos.
Considerando a necessidade de novas alternativas terapêuticas para o tratamento de diabetes e as propriedades intrínsecas das CTM, propomos avaliar nesse projeto a segurança, o efeito terapêutico e os mecanismos de ação da infusão CTM alogênicas no tratamento de DM-1 recém-diagnosticado em humanos e em modelos animais de DM-1 e DM-2.
Avaliaremos a resposta imunológica (freqüência de subpopulações de células T naive, memória e células T reguladoras, dosagem de citocinas no soro, repertório de células T, freqüência de células T auto-reativas anti-células beta pancreáticas) nos pacientes em diversos períodos após a infusão das CTM. Paralelamente aos estudos em humanos, propomos avaliar nesse projeto os mecanismos imunológicos e regenerativos envolvidos na resposta terapêutica, à infusão de CTM, de dois modelos de diabete auto-imune tipo 1 (um modelo geneticamente determinado e o outro quimicamente induzido) na fase inicial e fase crônica da doença. Além disso, avaliaremos nesse projeto o efeito terapêutico da infusão de CTM em camundongos com DM-2, bem como os mecanismos imunológicos e regenerativos envolvidos nesta resposta terapêutica. Avaliaremos nestes modelos animais de DM-1 e DM-2 a modulação da resposta auto-imune patogênica pelas CTM, bem como o papel das CTM na regeneração do tecido pancreático lesado pela agressão auto-imune.
Os resultados obtidos neste projeto demonstrarão o efeito terapêutico da infusão de CTM no tratamento do DM-1 recém-diagnosticado em humanos e do DM-1 crônico e DM-2 em modelos experimentais, bem como elucidarão os mecanismos imunológicos e regenerativos envolvidos na resposta terapêutica dos animais diabéticos à infusão de CTM. Se demonstrada uma boa eficácia terapêutica, sem a ocorrência de efeitos tóxicos relevantes, a infusão de CTM pode se tornar uma alternativa terapêutica para o tratamento do DM-1 e do DM-2, que constituem doenças associadas à baixa qualidade de vida em longo prazo e necessidade de tratamento crônico de alto custo.
Por outro lado, o diabetes mellitus tipo 2 (DM-2) é uma doença metabólica associada basicamente a dois mecanismos, a resistência à ação da insulina e a disfunção secretória das células beta pancreáticas. Os mecanismos moleculares que determinam a deficiência secretória de insulina ou a sua ação deficiente não estão bem definidos e estão sendo objeto de intensa investigação nos últimos anos. Entretanto, há evidências abundantes da presença de um importante componente inflamatório envolvido na patogênese da resistência insulínica e da disfunção das células beta pancreáticas. A resistência insulínica, um dos principais fatores patogênicos do DM-2, está freqüentemente associada a outros fatores de risco cardiovascular, como hipertensão, obesidade e dislipidemia. Na última década, o DM-2, que representa 90-95% dos casos de diabetes, tornou-se um importante problema clínico e de saúde pública em todo o mundo. As complicações crônicas do DM-2, que se instalam em longo prazo, decorrem de alterações micro e macrovasculares que levam a disfunção, dano ou falência de vários órgãos. Todo esse quadro incorre em elevado custo econômico e social, comprometendo a produtividade, a qualidade de vida e a sobrevida da população.
O DM-1 é tratado pela terapia convencional com insulina ou terapia intensiva com insulina. Ensaios clínicos com imunossupressores, anticorpo monoclonal anti-CD3 e o transplante de ilhotas pancreáticas vêm sendo realizados com resultados significativos, mas insuficientes para aplicação clínica rotineira. Já, o tratamento do DM-2 envolve dieta, exercícios físicos, drogas orais e freqüentemente injeções diárias de insulina. Esse cenário estimula novas pesquisas acerca de alternativas terapêuticas para diabetes, tais como a diferenciação in vitro de células-tronco humanas em células β pancreáticas para transplante e tratamento do DM-1 com células-tronco adultas. Nesse contexto, as células-tronco mesenquimais (CTM) representam uma fonte de células-tronco adultas ideal para terapia celular em virtude de seu fácil isolamento, expansão in vitro e capacidade imunossupressora, imunoreguladora e regenerativa.
Trabalhos recentes demonstraram um efeito terapêutico satisfatório após infusões de CTM em modelos animais de DM-1 (na fase inicial da doença) e em pacientes com a doença do enxerto-versus-hospedeiro, doença cujos mecanismos imunológicos assemelham-se aos das DAI. Adicionalmente, há observações em estudos experimentais que sugerem efeitos benéficos do transplante de células-tronco totais da medula óssea sobre a hiperglicemia e suas complicações no DM-2. Nesse contexto, nossa hipótese é que o diabetes possa ser controlado através da infusão das CTM, pois uma vez infundidas nos pacientes diabéticos elas migram preferencialmente para o tecido pancreático inflamado, promovem imunossupressão local e estimulam os mecanismos de regeneração locais através de efeitos parácrinos, os quais envolvem a produção de moléculas anti-inflamatórias e imunoreguladoras e de fatores de crescimento e angiogênicos.
Considerando a necessidade de novas alternativas terapêuticas para o tratamento de diabetes e as propriedades intrínsecas das CTM, propomos avaliar nesse projeto a segurança, o efeito terapêutico e os mecanismos de ação da infusão CTM alogênicas no tratamento de DM-1 recém-diagnosticado em humanos e em modelos animais de DM-1 e DM-2.
Avaliaremos a resposta imunológica (freqüência de subpopulações de células T naive, memória e células T reguladoras, dosagem de citocinas no soro, repertório de células T, freqüência de células T auto-reativas anti-células beta pancreáticas) nos pacientes em diversos períodos após a infusão das CTM. Paralelamente aos estudos em humanos, propomos avaliar nesse projeto os mecanismos imunológicos e regenerativos envolvidos na resposta terapêutica, à infusão de CTM, de dois modelos de diabete auto-imune tipo 1 (um modelo geneticamente determinado e o outro quimicamente induzido) na fase inicial e fase crônica da doença. Além disso, avaliaremos nesse projeto o efeito terapêutico da infusão de CTM em camundongos com DM-2, bem como os mecanismos imunológicos e regenerativos envolvidos nesta resposta terapêutica. Avaliaremos nestes modelos animais de DM-1 e DM-2 a modulação da resposta auto-imune patogênica pelas CTM, bem como o papel das CTM na regeneração do tecido pancreático lesado pela agressão auto-imune.
Os resultados obtidos neste projeto demonstrarão o efeito terapêutico da infusão de CTM no tratamento do DM-1 recém-diagnosticado em humanos e do DM-1 crônico e DM-2 em modelos experimentais, bem como elucidarão os mecanismos imunológicos e regenerativos envolvidos na resposta terapêutica dos animais diabéticos à infusão de CTM. Se demonstrada uma boa eficácia terapêutica, sem a ocorrência de efeitos tóxicos relevantes, a infusão de CTM pode se tornar uma alternativa terapêutica para o tratamento do DM-1 e do DM-2, que constituem doenças associadas à baixa qualidade de vida em longo prazo e necessidade de tratamento crônico de alto custo.
Pesquisador: Manoel João Batista Castello Girão/ Instituto: UNIFESP-SP
Estudo histomorfométrico e imunohistoquímico da uretra de ratas adultas com injeção de células-tronco de medula óssea após trauma simulado de parto e em fêmeas adultas com injeção de célula
A incontinência urinária (IU) é uma condição na qual ocorre perda involuntária de urina. Já a incontinência urinária de esforço (IUE) é definida como toda perda de urina decorrente de algum esforço físico como pular, correr e tossir. Devemos ressaltar o número de gestações e o tipo de parto como fatores predisponentes, pois podem lesar o sistema de suspensão e sustentação dos órgãos pélvicos.
A lesão do assoalho pélvico ocorre, em geral, pela compressão de partes fetais contra tecidos maternos, o que determina secção e estiramento de músculos e nervos e, ainda, desarranjo estrutural do tecido conjuntivo e das fáscias, alterando toda a estática pélvica, podendo ocasionar perda de urina.
A medicina regenerativa é um novo campo da Medicina que agrega diversos campos da engenharia tissular. Entre estes, destaca-se a utilização de células-tronco, que desenvolve substitutos biológicos para restaurar e manter as funções originais de órgãos e tecidos. Existem diversos tipos de estudos com células de diferentes origens com este objetivo.
O objetivo deste trabalho é avaliar a possibilidade de regeneração do assoalho pélvico, uretra e bexiga por células-tronco embrionárias de camundongos fêmeas após trauma simulado de parto; assim como de ratas adultas com células-tronco adultas da medula óssea. Os tecidos a serem analisados após trauma de parto e terapia celular serão músculo, nervo, vaso e colágeno.
A lesão do assoalho pélvico ocorre, em geral, pela compressão de partes fetais contra tecidos maternos, o que determina secção e estiramento de músculos e nervos e, ainda, desarranjo estrutural do tecido conjuntivo e das fáscias, alterando toda a estática pélvica, podendo ocasionar perda de urina.
A medicina regenerativa é um novo campo da Medicina que agrega diversos campos da engenharia tissular. Entre estes, destaca-se a utilização de células-tronco, que desenvolve substitutos biológicos para restaurar e manter as funções originais de órgãos e tecidos. Existem diversos tipos de estudos com células de diferentes origens com este objetivo.
O objetivo deste trabalho é avaliar a possibilidade de regeneração do assoalho pélvico, uretra e bexiga por células-tronco embrionárias de camundongos fêmeas após trauma simulado de parto; assim como de ratas adultas com células-tronco adultas da medula óssea. Os tecidos a serem analisados após trauma de parto e terapia celular serão músculo, nervo, vaso e colágeno.
Pesquisador: Mari Cleide Sogayar/ Instituto: USP-SP
Diferenciação de células-tronco embrionárias e mesenquimais de pele e de polpa dentaria em osteoblastos e em células beta pancreáticas visando a terapia celular de doenças degenerativas
O Diabetes mellitus (DM) é uma das maiores causas de morbidade e mortalidade no Mundo, podendo ser classificado em tipo 1 e 2. O DM1 é causado, primariamente, pela destruição das células beta-pancreáticas por processos auto-imunes, sendo caracterizado pela deficiência absoluta de insulina. Há uma grande dificuldade de obtenção de pâncreas para transplantes, tanto de órgão total como de ilhotas. Sendo assim, a diferenciação beta-pancreática a partir de células-tronco se torna uma possibilidade atraente como possível alternativa para a obtenção de massa suficiente de células β para transplante. Uma fonte promissora de células beta são as células-tronco embrionárias. A diferenciação de células-tronco embrionárias murinas em células β, secretoras de insulina foi realizada com sucesso em nosso laboratório.
Entretanto, apesar de produzir insulina, essas células não foram efetivas em reverter o diabetes em um modelo pré-clínico de camundongos diabetizados, provavelmente devido à baixa viabilidade de células transplantadas. Este quadro poderia ser revertido através de uma inovadora metodologia recentemente implantada em nosso laboratório, que consiste em microencapsular células ou ilhotas para aumentar sua viabilidade.Uma outra fonte para de células β são as células-tronco adultas, encontradas em diversos tecidos de indivíduos adultos, incluindo: medula óssea, tecido neural, retina, tecido muscular, pele e dente.
O isolamento e cultivo de duas linhagens de células-tronco de polpa dentária humana e três linhagens de células-tronco de pele murina foi estabelecido em nosso laboratório. Esses tecidos consistem em fontes acessíveis de material biológico para a obtenção de células. Essas células mostraram um amplo espectro de diferenciação, tornando-as boas candidatas para a terapia celular de osteodiferenciação. Os traumas e as fraturas ósseas em idosos representam um grave problema de Saúde pública. Uma abordagem promissora é dada pelo tratamento com BMPs, que, em testes clínicos e pré-clínicos mostraram ser eficientes na indução de formação óssea ectópica em murinos e humanos, além de diminuir o tempo de internação e os custos e, ainda, evitar a reincidência da fratura. Recentemente, foram produzidas, pelo nosso laboratório, as BMP2 e BMP7 humanas recombinantes (rhBMP2 e rhBMP7), em células de mamíferos.
Estas proteínas se mostraram capazes de induzir a osteogênese em modelo celular de pré-mioblastos (linhagem C2C12 de camundongo). A purificação destas proteínas recombinantes e seu uso conjunto com células-tronco abre perspectivas extremamente promissoras, uma vez que diversos estudos pré-clínicos demonstraram que induzem regeneração de tecidos ósseos e cartilaginosos, além de acelerar a recuperação de discos inter-vertebrais em procedimentos de artrodese. Assim, estamos propondo uma abordagem de diferenciação de células-tronco advindas de tecidos de fácil obtenção, como a pele e a polpa dentária, em células produtoras e secretoras de insulina. Visamos, também, aumentar o tempo de sobrevida destas células-tronco in vivo através de seu encapsulamento. Estas mesmas células serão usadas para a osteodiferenciação através da exposição a rhBMP 2 e 7, na tentativa de gerar protocolos que sejam efetivos no reparo de perdas ou lesões ósseas.
Entretanto, apesar de produzir insulina, essas células não foram efetivas em reverter o diabetes em um modelo pré-clínico de camundongos diabetizados, provavelmente devido à baixa viabilidade de células transplantadas. Este quadro poderia ser revertido através de uma inovadora metodologia recentemente implantada em nosso laboratório, que consiste em microencapsular células ou ilhotas para aumentar sua viabilidade.Uma outra fonte para de células β são as células-tronco adultas, encontradas em diversos tecidos de indivíduos adultos, incluindo: medula óssea, tecido neural, retina, tecido muscular, pele e dente.
O isolamento e cultivo de duas linhagens de células-tronco de polpa dentária humana e três linhagens de células-tronco de pele murina foi estabelecido em nosso laboratório. Esses tecidos consistem em fontes acessíveis de material biológico para a obtenção de células. Essas células mostraram um amplo espectro de diferenciação, tornando-as boas candidatas para a terapia celular de osteodiferenciação. Os traumas e as fraturas ósseas em idosos representam um grave problema de Saúde pública. Uma abordagem promissora é dada pelo tratamento com BMPs, que, em testes clínicos e pré-clínicos mostraram ser eficientes na indução de formação óssea ectópica em murinos e humanos, além de diminuir o tempo de internação e os custos e, ainda, evitar a reincidência da fratura. Recentemente, foram produzidas, pelo nosso laboratório, as BMP2 e BMP7 humanas recombinantes (rhBMP2 e rhBMP7), em células de mamíferos.
Estas proteínas se mostraram capazes de induzir a osteogênese em modelo celular de pré-mioblastos (linhagem C2C12 de camundongo). A purificação destas proteínas recombinantes e seu uso conjunto com células-tronco abre perspectivas extremamente promissoras, uma vez que diversos estudos pré-clínicos demonstraram que induzem regeneração de tecidos ósseos e cartilaginosos, além de acelerar a recuperação de discos inter-vertebrais em procedimentos de artrodese. Assim, estamos propondo uma abordagem de diferenciação de células-tronco advindas de tecidos de fácil obtenção, como a pele e a polpa dentária, em células produtoras e secretoras de insulina. Visamos, também, aumentar o tempo de sobrevida destas células-tronco in vivo através de seu encapsulamento. Estas mesmas células serão usadas para a osteodiferenciação através da exposição a rhBMP 2 e 7, na tentativa de gerar protocolos que sejam efetivos no reparo de perdas ou lesões ósseas.
Pesquisador: Maria Angelica Miglino/ Instituto: USP-SP
Uso de células-tronco humanas imaturas de polpa de dente em modelos animais experimentais de doenças traumáticas adquiridas e neurológicas
Nas últimas duas décadas, com o avanço do conhecimento e das técnicas moleculares, a ciência conseguiu gerar informações importantes para o diagnóstico e tratamento de uma série de doenças outrora sem tratamento. Entretanto, patologias ósseas e lesões medulares permanecem ainda sem tratamento efetivo. Os defeitos ósseos são responsáveis pela perda da capacidade laboral e da qualidade de vida de milhões de pessoas em todo o mundo, constituindo um problema de saúde pública, assim como encontrado na lesão traumática medular, onde se pode observar um índice elevado de pacientes, sendo a maioria jovens, com predomínio do sexo masculino, e no auge de sua produtividade. O índice de morbidade e mortalidade é elevado e sua incidência aumenta cerca de 4% ao ano. O comprometimento dos sistemas ósseo e nervoso que ocorre nesses casos permanece um desafio médico pela falta de instrumentos efetivos na solução desses problemas e atualmente, através de investimentos em pesquisas nesta área, alguns resultados promissores são registrados. Estudos com modelos animais tem mostrado que transplante de células tronco podem ter sucesso no tratamento de muitas doenças crônicas, como imperfeições osteogênicas, doenças da medula espinhal, distrofia muscular de Duchenne, Parkinson, diabetes, degeneração das células de Purkinjie, falência de fígado e coração. Sendo assim, julgamos ser necessários trabalhos que apresentem como principal objetivo a contribuição na melhora da qualidade de vida destes pacientes, portanto disponibilizamos neste estudo dois modelos animais: ovino o qual trabalharemos na forma de contribuir com os defeitos ósseos e os caninos que apresentam a patologia de lesão medular similar aos humanos. Para os modelos pré-clínicos, em relação a patologias ósseas, para sua correção faz-se necessário a utilização de enxertias, que podem ser ósseas ou de biomateriais. Entretanto, as desvantagens e limitações desses métodos disponíveis para tais reconstruções faz da busca por uma técnica menos invasiva, mais segura e mais previsível, uma necessidade imediata. A bioengenharia de tecidos, que trabalha com a tríade células/scaffolds/moléculas sinalizadoras tem-se mostrado muito promissora para tais fins. Neste trabalho utilizaremos como scaffold uma biocerâmica de hidroxiapatita (HA) e ß-tricálcio fosfato (ß-TCP), em forma de grânulos e blocos, sobre as quais serão cultivadas células isoladas da polpa dental, chamadas CTIPDs (isoladas e caracterizada pelo nosso grupo), para a obtenção de um complexo tridimencional. A diferenciação osteoblástica ocorrerá através de modificações dos respectivos meios de cultura, suplementados com fatores de diferenciação. A aplicação clínica consistirá na utilização do complexo tridimensional selecionado, para a reconstrução de falhas ósseas de tamanhos críticos realizados em tíbias de ovelhas. Os resultados serão avaliados histomorfometricamente. Em relação a lesões medulares, no modelo canino, com estas já adquiridas serão tratadas com cirurgia descompressiva, seguido de transplante das células de polpa dentária local, entretanto um grupo receberá estas mesmas células através de punção na região do espaço atlantocciptal. Nosso grupo isolou e caracterizou as células tronco imaturas da polpa de dente (CTIPD). Devido as suas características, estas células podem ser classificadas como Células Tronco Adultas Multipotentes (CTAMs), que é um tipo de célula intermediária entre as células tronco embrionárias e CTAs. Demonstramos também que as CTIPD apresentam o perfil de expressão semelhante àquele observado nas CTE humanas, sem risco de rejeição ou formação de teratomas. Para tanto, iremos usar estes tipos de células-tronco no tratamento destas lesões adquiridas traumáticas e neurológicas.
Pesquisador: Maria Isabel Doria Rossi/ Instituto: UFRJ-RJ
Papel das interações celulares na migração e proliferação de progenitores hematopoéticos e células tumorais na diferenciação osteogênica
Os avanços na área de Bioengenharia tecidual e terapia celular levantam inúmeras questões científicas, entre as quais encontram-se as relacionadas com as interações celulares que formam um microambiente informativo, capaz de controlar o destino de células-tronco normais e neoplásicas. Assim, mecanismos de diferenciação de células mesenquimais do estroma da medula óssea e seu papel na organização tridimensional de nicho capaz de regular a migração e quiescência de progenitores hematopoéticos e células neoplásicas serão investigados. Será dada particular atenção ao papel da ativação da via de Wnt, de moléculas de adesão (caderinas e integrinas) e da quimiocina CXCL12 no controle da diferenciação osteogênica de células mesenquimais do estroma da medula óssea e na interação de progenitores hematopoéticos e células de tumor de mama e próstata com o microambiente medular em modelo de cultura tridimensional que mimetiza o nicho subendosteal. Será dada particular atenção a caracterização de células-tronco neoplásicas. O potencial de diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas isoladas de diferentes fontes será investigado em microambiente embrionário que permite interações entre os diferentes folhetos embrionários.
Pesquisador: Maria Rita Passos Bueno/ Instituto: USP-SP
Células-tronco na compreensão e reabilitação de doenças craniofaciais
O nosso grupo de pesquisa tem como principal foco investir na pesquisa de células tronco para melhorar a reabilitação de pacientes com síndromes craniofaciais, com menor morbidade e complicações pós-cirúrgicas. Nestes últimos 3 anos, quando então iniciamos pesquisa nesta área, caracterizamos um modelo animal para o estudo de reconstrução óssea craniana com células tronco associadas a biomateriais, bem como caracterizamos uma nova fonte de célula tronco a partir de fragmentos de músculo orbicular do lábio, que são regularmente descartadas em cirurgias corretivas de pacientes com fissuras lábio-palatinas (Costa et al., 2008, Bueno et al., 2007/patente, Bueno et al., 2008; vide Lattes). Na presente proposta, iremos dar continuidade a melhor caracterização das células tronco derivadas de músculo orbicular de lábio, como por exemplo verificar se estas apresentam o mesmo potencial osteogênico que as células de polpa de dente, utilizando o modelo animal já estabelecido.
Além disso, pretendemos: a) identificar genes que atuem durante o desenvolvimento embrionário e que sejam críticos para osteogênese dos ossos craniofaciais; para atingirmos este objetivo iremos realizar estudos funcionais em células tronco obtidas de pacientes com síndromes craniofaciais; b) desenvolver um modelo animal que seja equivalente ao das fissuras lábio-palatinas e avaliar o potencial de regeneração óssea deste defeito utilizando-se células tronco combinadas a biomateriais; c) verificar se células tronco combinadas com genes importantes para angiogênese levam a um poder de ossificação mais eficiente; d) desenvolver biomateriais nacionais que combinados com células tronco sejam eficientes no processo de regeneração óssea craniofacial. Para o presente projeto organizamos uma equipe multidisciplinar constituída de profissionais com expertise na área de terapia gênica (Prof. Menck) e de biomateriais (Prof. Élson Longo).
Além disso, pretendemos: a) identificar genes que atuem durante o desenvolvimento embrionário e que sejam críticos para osteogênese dos ossos craniofaciais; para atingirmos este objetivo iremos realizar estudos funcionais em células tronco obtidas de pacientes com síndromes craniofaciais; b) desenvolver um modelo animal que seja equivalente ao das fissuras lábio-palatinas e avaliar o potencial de regeneração óssea deste defeito utilizando-se células tronco combinadas a biomateriais; c) verificar se células tronco combinadas com genes importantes para angiogênese levam a um poder de ossificação mais eficiente; d) desenvolver biomateriais nacionais que combinados com células tronco sejam eficientes no processo de regeneração óssea craniofacial. Para o presente projeto organizamos uma equipe multidisciplinar constituída de profissionais com expertise na área de terapia gênica (Prof. Menck) e de biomateriais (Prof. Élson Longo).
Pesquisador: Marimélia Porcionatto/ Instituto: UNIFESP-SP
Efeito de peptídeos derivados da quimiocina SDF-1/CXCL12 sobre a migração, proliferação, sobrevivência e diferenciação de células-tronco neurais
Traumas físicos e acidentes vasculares ocasionam lesões ao sistema nervoso central que representam um grande problema de saúde. Atualmente, não há tratamento específico para lesões como o traumatismo cranioencefálico, acidente vascular encefálico e lesões medulares. Entre todas as doenças neurológicas da vida adulta, o acidente vascular encefálico ocupa o primeiro lugar em freqüência e importância, sendo a terceira causa de morte e a maior causa de incapacidade permanente no ocidente. O traumatismo cranioencefálico e a lesão medular, que resultam de dano físico repentino e externo à cabeça ou à medula espinhal, freqüentemente, têm como conseqüência déficits cognitivos e motores com graus variados de severidade. As lesões no sistema nervoso central resultam em reação glial, levando à formação de uma cicatriz que consiste na deposição na matriz extracelular de fatores inibitórios da remielinização e da extensão axonal. Essas moléculas são secretadas por oligodendrócitos e astrócitos reativos que migram para o local da lesão.
A incapacidade das fibras nervosas de regenerar leva à morte do corpo celular correspondente e as fibras não danificadas nas regiões próximas aos axônios lesados são afetadas pelo espalhamento lateral da injúria e sofrem degeneração secundária. Estratégias terapêuticas complementares têm sido testadas, como o transplante alogênico de células-tronco derivadas da medula óssea em lesados medulares, porém esses tratamentos experimentais ainda não surtiram os efeitos desejados. Presumivelmente, fatores intrínsecos de recuperação desse tipo de lesão estão ligados à presença de células-tronco neurais endógenas que parecem ser capazes de atuar como neuroprotetoras e/ou neuroregenerativas.
As células-tronco endógenas presentes em regiões neurogênicas como a zona subventricular e a camada subgranular do hipocampo migram para a lesão em respostas a estímulos quimiotáticos secretados por células da glia e células do sistema imune presentes na lesão. Um dos fatores quimiotáticos envolvidos no estímulo migratório das células-tronco endógenas é a citocina SDF-1/CXCL12. Embora já tenha sido demonstrado que células-tronco neurais são capazes de alcançar a lesão, muitas delas morrem por mecanismos ainda desconhecidos. Possivelmente, as citocinas anti- e pró-inflamatórias presentes na lesão, exercem influência não só na quimiotaxia, mas também no destino final das células-tronco neurais que chegam à lesão. Além das citocinas e das moléculas inibitórias do crescimento axonal, a glia reativa aumenta a expressão de metaloproteases de matriz (MMPs) que, entre outras ações, degradam algumas citocinas. Já está descrito na literatura que a degradação de SDF-1/CXCL12 por MMPs causa a inativação dessa quimiocina, no entanto, é possível que a clivagem de SDF-1/CXCL12 gere peptídeos bioativos que poderiam funcionar como estimuladores da diferenciação e inibidores da morte celular. Desta maneira, este projeto visa estudar o processo de migração de células-tronco neurais estimulada por peptídeos derivados de SDF-1/CXCL12 in vitro, bem como avaliar os efeitos desses peptídeos sobre a proliferação, sobrevivência e diferenciação das células-tronco neurais.
Esperamos que os resultados obtidos neste projeto possam esclarecer pontos importantes sobre os mecanismos celulares e moleculares da quimiotaxia, sobrevivência e diferenciação de células-tronco neurais endógenas em resposta a uma lesão no sistema nervoso central e indicar possibilidades futuras de tratamento pelo aumento da atividade quimiotática por modificações estruturais em peptídeos sintéticos, bem como pela manipulação química da atividade das enzimas envolvidas no processamento de SDF-1/CXCL12 in vivo.
A incapacidade das fibras nervosas de regenerar leva à morte do corpo celular correspondente e as fibras não danificadas nas regiões próximas aos axônios lesados são afetadas pelo espalhamento lateral da injúria e sofrem degeneração secundária. Estratégias terapêuticas complementares têm sido testadas, como o transplante alogênico de células-tronco derivadas da medula óssea em lesados medulares, porém esses tratamentos experimentais ainda não surtiram os efeitos desejados. Presumivelmente, fatores intrínsecos de recuperação desse tipo de lesão estão ligados à presença de células-tronco neurais endógenas que parecem ser capazes de atuar como neuroprotetoras e/ou neuroregenerativas.
As células-tronco endógenas presentes em regiões neurogênicas como a zona subventricular e a camada subgranular do hipocampo migram para a lesão em respostas a estímulos quimiotáticos secretados por células da glia e células do sistema imune presentes na lesão. Um dos fatores quimiotáticos envolvidos no estímulo migratório das células-tronco endógenas é a citocina SDF-1/CXCL12. Embora já tenha sido demonstrado que células-tronco neurais são capazes de alcançar a lesão, muitas delas morrem por mecanismos ainda desconhecidos. Possivelmente, as citocinas anti- e pró-inflamatórias presentes na lesão, exercem influência não só na quimiotaxia, mas também no destino final das células-tronco neurais que chegam à lesão. Além das citocinas e das moléculas inibitórias do crescimento axonal, a glia reativa aumenta a expressão de metaloproteases de matriz (MMPs) que, entre outras ações, degradam algumas citocinas. Já está descrito na literatura que a degradação de SDF-1/CXCL12 por MMPs causa a inativação dessa quimiocina, no entanto, é possível que a clivagem de SDF-1/CXCL12 gere peptídeos bioativos que poderiam funcionar como estimuladores da diferenciação e inibidores da morte celular. Desta maneira, este projeto visa estudar o processo de migração de células-tronco neurais estimulada por peptídeos derivados de SDF-1/CXCL12 in vitro, bem como avaliar os efeitos desses peptídeos sobre a proliferação, sobrevivência e diferenciação das células-tronco neurais.
Esperamos que os resultados obtidos neste projeto possam esclarecer pontos importantes sobre os mecanismos celulares e moleculares da quimiotaxia, sobrevivência e diferenciação de células-tronco neurais endógenas em resposta a uma lesão no sistema nervoso central e indicar possibilidades futuras de tratamento pelo aumento da atividade quimiotática por modificações estruturais em peptídeos sintéticos, bem como pela manipulação química da atividade das enzimas envolvidas no processamento de SDF-1/CXCL12 in vivo.
Pesquisador: Mauro Martins Teixeira/ Instituto: UFMG - MG
Estudo pré-clínico do uso terapêutico de células progenitoras endoteliais pré-condicionadas ex vivo na revascularização de tecidos isquêmicos
A doença arterial periférica, também conhecida como doença vascular periférica, é uma doença crônica que progressivamente dificulta a circulação arterial dos membros. Em geral, esses danos arteriais são secundários à hipertensão arterial e/ou à formação de placas ateroscleróticas. Caso o tratamento com medicação ou procedimentos endovasculares ou cirúrgicos não sejam bem sucedidos, a maioria desses pacientes sofrerá a amputação dos membros afetados. Consequentemente, a exploração de novas estratégias terapêuticas para a revascularização de tecidos isquêmicos é de grande importância.
Na última década, têm sido pesquisadas terapias que visem o aumento do fluxo sanguíneo para os tecidos isquêmicos através do transplante de células-tronco que promovam o desenvolvimento local de novos vasos sanguíneos. Por exemplo, a terapia celular fundamentada no transplante de células progenitoras endoteliais (CPEs), uma população de células-tronco unipotentes, poderia resultar não apenas na diferenciação dessas células em células endoteliais maduras (vasculogênese) e assim contribuir para a neovascularização reparadora, mas também na produção de vários fatores de crescimento capazes de estimular a angiogênese (formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existents) e a arteriogênese (formação de vasos colaterais) através de mecanismos parácrinos.
Estudos clínicos relatam resultados promissores da terapia baseada em CPEs para o tratamento de isquemia crônica de membros, entretanto, os resultados ainda são modestos quando comparados aos estudos pré-clínicos. Descoberta recente mostra que a bradicinina atuando no receptor B2 em CPEs e ativando a via Akt/eNOS é um dos mecanismos envolvidos na migração dessas células para tecidos isquêmicos (artigo no prelo). Inibidores da enzima conversora de angiotensina I (iECA), amplamente utilizados como agentes anti-hipertensivos, foram demonstrados possuir efeitos pró-angiogênicos mediados pela ativação do receptor B2 de bradicinina por mecanismos independentes do bloqueio da inativação da enzima. Mecanismos similares também são observados nos efeitos anti-hipertensivos da angiotensina-(1-7). Interessantemente, o efeito potenciador da bradicinina como consequência do tratamento com iECA pode ser revertido por um antagonista do receptor MAS de angiotensina-(1-7). A atividade potenciadora da bradicinina (BK) é a propriedade biológica mais conhecida dos peptideos isolados do veneno da Bothrops jararaca (BPPs, da sigla inglesa “bradykinin-potentiating peptide”). A estes foi inicialmente atribuída ação inibitória sobre a ECA.
No entanto, recentemente demonstrou-se que as atividades anti-hipertensivas dos BPPs pode também ocorrer por mecanismos independentes de ECA, tais como, por exemplo, o aumento da produção de óxido nítrico através da ligação direta à enzima argininosuccinato sintase (AsS). O aprimoramento farmacológico das funções adesivas e migratórias das CPEs, da capacidade destas de se incorporarem aos vasos sanguíneos em formação ou mesmo da capacidade de liberação de fatores angiogênicos representa uma nova área de pesquisa que poderá levar ao desenvolvimento de novas estratégias para o aumento da eficiência de transplantação de CPEs. Uma vez que BPPs são capazes de ativar funções angiogênicas de células endoteliais (e possivelmente de CPEs), nós hipotetizamos que BPPs seriam capazes de aumentar a neovascularização reparadora de tecidos isquêmicos através do aumento do recrutamento de CPEs e do aprimoramento das funções destas.
Além disso, o pré-condicionamento de CPEs (provenientes de indivíduos sadios ou de pacientes com hipertensão) ex vivo com BPPs antes do transplante pode ser capaz de aumentar o potencial vasculogênico/angiogênico dessas células, aumentando, assim, a eficiência do transplante de CPEs. Dessa maneira, o presente projeto de pesquisa tem como meta principal o desenvolvimento de estratégia terapêutica inovadora na terapia celular de revascularização de tecidos isquêmicos através do aumento da eficiência terapêutica de células progenitoras endoteliais pré-condicionadas ex vivo com peptídeos potenciadores da bradicinina. No caso do nosso estudo, serão utilizadas CPEs derivadas do sangue de cordão umbilical pelo fato de estas serem mais prevalentes por volume de sangue equivalente quando comparadas com CPEs derivadas do sangue periférico de indivíduos adultos sadios e por possuirem maior potencial proliferativo, entre outros. Além disso, será possível inclusive avaliar a capacidade desses peptídeos em resgatar ou mesmo aumentar as propriedades vasculogênicas/angiogênicas de CPEs provenientes de pacientes com pré-eclampsia, um tipo de hipertensão induzida pela gravidez.
Na última década, têm sido pesquisadas terapias que visem o aumento do fluxo sanguíneo para os tecidos isquêmicos através do transplante de células-tronco que promovam o desenvolvimento local de novos vasos sanguíneos. Por exemplo, a terapia celular fundamentada no transplante de células progenitoras endoteliais (CPEs), uma população de células-tronco unipotentes, poderia resultar não apenas na diferenciação dessas células em células endoteliais maduras (vasculogênese) e assim contribuir para a neovascularização reparadora, mas também na produção de vários fatores de crescimento capazes de estimular a angiogênese (formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existents) e a arteriogênese (formação de vasos colaterais) através de mecanismos parácrinos.
Estudos clínicos relatam resultados promissores da terapia baseada em CPEs para o tratamento de isquemia crônica de membros, entretanto, os resultados ainda são modestos quando comparados aos estudos pré-clínicos. Descoberta recente mostra que a bradicinina atuando no receptor B2 em CPEs e ativando a via Akt/eNOS é um dos mecanismos envolvidos na migração dessas células para tecidos isquêmicos (artigo no prelo). Inibidores da enzima conversora de angiotensina I (iECA), amplamente utilizados como agentes anti-hipertensivos, foram demonstrados possuir efeitos pró-angiogênicos mediados pela ativação do receptor B2 de bradicinina por mecanismos independentes do bloqueio da inativação da enzima. Mecanismos similares também são observados nos efeitos anti-hipertensivos da angiotensina-(1-7). Interessantemente, o efeito potenciador da bradicinina como consequência do tratamento com iECA pode ser revertido por um antagonista do receptor MAS de angiotensina-(1-7). A atividade potenciadora da bradicinina (BK) é a propriedade biológica mais conhecida dos peptideos isolados do veneno da Bothrops jararaca (BPPs, da sigla inglesa “bradykinin-potentiating peptide”). A estes foi inicialmente atribuída ação inibitória sobre a ECA.
No entanto, recentemente demonstrou-se que as atividades anti-hipertensivas dos BPPs pode também ocorrer por mecanismos independentes de ECA, tais como, por exemplo, o aumento da produção de óxido nítrico através da ligação direta à enzima argininosuccinato sintase (AsS). O aprimoramento farmacológico das funções adesivas e migratórias das CPEs, da capacidade destas de se incorporarem aos vasos sanguíneos em formação ou mesmo da capacidade de liberação de fatores angiogênicos representa uma nova área de pesquisa que poderá levar ao desenvolvimento de novas estratégias para o aumento da eficiência de transplantação de CPEs. Uma vez que BPPs são capazes de ativar funções angiogênicas de células endoteliais (e possivelmente de CPEs), nós hipotetizamos que BPPs seriam capazes de aumentar a neovascularização reparadora de tecidos isquêmicos através do aumento do recrutamento de CPEs e do aprimoramento das funções destas.
Além disso, o pré-condicionamento de CPEs (provenientes de indivíduos sadios ou de pacientes com hipertensão) ex vivo com BPPs antes do transplante pode ser capaz de aumentar o potencial vasculogênico/angiogênico dessas células, aumentando, assim, a eficiência do transplante de CPEs. Dessa maneira, o presente projeto de pesquisa tem como meta principal o desenvolvimento de estratégia terapêutica inovadora na terapia celular de revascularização de tecidos isquêmicos através do aumento da eficiência terapêutica de células progenitoras endoteliais pré-condicionadas ex vivo com peptídeos potenciadores da bradicinina. No caso do nosso estudo, serão utilizadas CPEs derivadas do sangue de cordão umbilical pelo fato de estas serem mais prevalentes por volume de sangue equivalente quando comparadas com CPEs derivadas do sangue periférico de indivíduos adultos sadios e por possuirem maior potencial proliferativo, entre outros. Além disso, será possível inclusive avaliar a capacidade desses peptídeos em resgatar ou mesmo aumentar as propriedades vasculogênicas/angiogênicas de CPEs provenientes de pacientes com pré-eclampsia, um tipo de hipertensão induzida pela gravidez.
Pesquisador: Michel Eid Farah/ Instituto: UNIFESP-SP
Injeção sub-retiniana de células-tronco de medula óssea humana em camundongos transgênicos com degeneração de fotorreceptores
A retinose pigmentar (RP) é uma degeneração progressiva das células fotoreceptoras retinianas (cones e bastonetes) que se inicia na periferia e caminha em direção da mácula cujo principais sintomas estão a dificuldade progressiva de visão noturna e fechamento do campo visual. . Até o momento não há cura para RP, e os tratamentos que existem são de benefício duvidoso ou limitado em retardar a progressão da doença, havendo necessida de novas formas de tratamento para essa patologia.
O objetivo deste estudo é avaliar a capacidade de sobrevivência, integração, migração e diferenciação de células tronco humanas provenientes da medula óssea transplantadas para o espaço sub-retiniano em um modelo animal geneticamente modificado onde ocorre a degeneração do EPR e fotorreceptores da retina de camundongos.
Primeiramente será feita a coleta de medula óssea humana em asa da crista ilíaca posterior e preparo das células tronco humana para obtenção de volume de 1 a 2 ul de solução. Para receber o transplante de células tronco sub-retinianas será utilizado dez camundongos C3H/Hej do sexo masculino, homozigotos para o alelo rd (rd/rd) com 2 meses de vida. Em olho direito será feita aplicação de 1-2 ul contendo solução de células progenitoras hematopoiéticas no espaço subrretiniano com agulha de 32 gauge, em olho esquerdo será injetado solução salina balanceada. Após 15 dias da aplicação os animais serão examinados com eletroretinografia para avaliação funcional e depois sacrificados para preparação do material para imunohistoquímica com anti-B tubulina III, anti GFAP, anti-epitélio pigmentar da retina e anti-rodopsina. Marcação por TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated biotinylated UTP Nick End Labelling) sera utilizado para detecção de células apoptóticas.
O objetivo deste estudo é avaliar a capacidade de sobrevivência, integração, migração e diferenciação de células tronco humanas provenientes da medula óssea transplantadas para o espaço sub-retiniano em um modelo animal geneticamente modificado onde ocorre a degeneração do EPR e fotorreceptores da retina de camundongos.
Primeiramente será feita a coleta de medula óssea humana em asa da crista ilíaca posterior e preparo das células tronco humana para obtenção de volume de 1 a 2 ul de solução. Para receber o transplante de células tronco sub-retinianas será utilizado dez camundongos C3H/Hej do sexo masculino, homozigotos para o alelo rd (rd/rd) com 2 meses de vida. Em olho direito será feita aplicação de 1-2 ul contendo solução de células progenitoras hematopoiéticas no espaço subrretiniano com agulha de 32 gauge, em olho esquerdo será injetado solução salina balanceada. Após 15 dias da aplicação os animais serão examinados com eletroretinografia para avaliação funcional e depois sacrificados para preparação do material para imunohistoquímica com anti-B tubulina III, anti GFAP, anti-epitélio pigmentar da retina e anti-rodopsina. Marcação por TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated biotinylated UTP Nick End Labelling) sera utilizado para detecção de células apoptóticas.
Pesquisador: Nance Beyer Nardi / Instituto: ULBRA - RS
Mapeamento do nicho regenerativo em lesões teciduais e potencial de resposta de populações específicas de células-tronco adultas
O emprego bem sucedido de células da medula óssea e sangue de cordão umbilical no tratamento de doenças hematológicas, durante os últimos 30 anos, levou mais recentemente a estudos visando a utilização desta mesma abordagem para outras patologias. Os resultados iniciais sugeriam que as CT presentes na medula óssea tinham um grande potencial de reparo de órgãos não-hematopoiéticos, tais como o fígado, cérebro e coração; a passagem destas expectativas para o cenário pré-clínico e clínico, entretanto, provou que estas observações não podiam ser universalmente reproduzidas e evidenciou a existência de artefatos metodológicos gerando falsos resultados nos experimentos iniciais. Enquanto as expectativas de utilização do potencial terapêutico das células-tronco adultas continuam a animar a comunidade científica, torna-se clara a necessidade de maior conhecimento básico sobre estas células, para o desenho de protocolos com base experimental consistente.
Os múltiplos estudos básicos, pré-clínicos e clínicos com emprego de células-tronco adultas restringem-se, em sua grande maioria, à administração de células tais como a fração mononuclear da medula óssea ou subpopulações mais purificadas, como as células-tronco mesenquimais, e à avaliação dos resultados em termos de correção da lesão. Esses estudos, que podemos chamar de “tipo início-e-fim”, ignoram os elementos e eventos presentes tanto na lesão quanto nas células administradas, e que são responsáveis pelo resultado final do procedimento.
Um dos pontos que exigem maior atenção, para melhor compreensão da biologia das CT adultas, é a questão do nicho. As células-tronco têm seu comportamento determinado por interações com seu micro-ambiente, ou nicho, que é composto por outras células, matriz extra-celular e fatores de sinalização. Estas interações determinam se a célula permanecerá quiescente ou entrará em mitose, originando neste caso outra CT e/ou progenitores comprometidos com a diferenciação. Este conceito é fundamental tanto para estudos básicos envolvendo a manutenção das CTs durante o cultivo in vitro, que exige a reprodução tão fiel quanto possível do nicho fisiológico, quanto para seu emprego em procedimentos terapêuticos. Se o tecido alvo não constituir uma “lesão adequada”, as células não o reconhecerão como nicho para aí exercerem sua funções de reparo. Assim, tão ou talvez mais importante que conhecer as células a serem terapeuticamente empregadas, é conhecer o sítio da lesão a ser corrigida.
O termo “nicho regenerativo” tem sido utilizado para descrever o conjunto de células presentes em um tecido lesado. Apesar de produzir fatores que visam atrair células regenerativas, o sítio da lesão representa também um microambiente hostil, necrótico ou isquêmico, que pode comprometer a sobrevivência de células transplantadas. Assim, a compreensão dos elementos e eventos aí atuantes é fundamental para o sucesso da intervenção.
Enquanto no cenário clínico outras análises são limitadas, em estudos pré-clínicos com emprego de modelos animais é possível avaliar a distribuição das células transplantadas e os mecanismos responsáveis pelo reparo. Ainda assim, estes pontos têm sido insuficientemente explorados. Como resultado, sabe-se muito pouco sobre os eventos celulares e moleculares que ocorrem no sítio da lesão e nas populações de células-tronco administradas. Este desconhecimento impede o desenho mais racional e eficiente de intervenções terapêuticas, que permanecem eminentemente empíricas.
O presente projeto propõe contribuir para esta definição, através do mapeamento detalhado dos eventos celulares e moleculares envolvidos em lesões teciduais em modelos murinos, e do potencial de resposta de células-tronco adultas murinas e humanas a estes elementos. Os modelos selecionados envolvem o infarto agudo do miocárdio e isquemia periférica, situações já bastante exploradas em estudos de terapia com células-tronco do tipo “início-e-fim” e, por esta mesma razão, adequadas para exploração em nível mais aprofundado.
O projeto envolve um grande grupo de pesquisadores, para adequada divisão das múltiplas tarefas conforme a infra-estrutura dos laboratórios e experiência dos participantes. A abordagem experimental envolve, basicamente, a produção cirúrgica das lesões em camundongos C57BL/6 e a análise detalhada e completa dos elementos presentes no nicho regenerativo, sempre em comparação ao tecido sadio. Para isto, serão produzidos cortes seriados para análise da morfologia, imunofenótipo, grau de proliferação e de apoptose das células dos sítios de lesão, e padrões de citocinas e fatores de crescimento produzidos. Análises destes tecidos por RT-PCR em tempo real informarão sobre perfis de expressão gênica. Identificando-se sinais e perfis mais interessantes em termos de regeneração tecidual, populações de células-tronco murinas e humanas serão avaliadas para seu potencial de resposta aos mesmos.
Serão analisadas a fração mononuclear da medula óssea humana e murina e populações purificadas de células-tronco mesenquimais, obtidas de medula óssea humana e da medula óssea, fígado, pulmão e rins de camundongos C57BL/6 GFP-positivos. As análises incluirão perfis de expressão gênica, produção de ligantes correspondentes aos principais sinais emitidos pelo sítio da lesão, características básicas e cariótipo das culturas de MSCs, padrão de distribuição das células murinas no nicho regenerativo após administração in situ ou sistêmica no modelo murino de IAM ou DAP, e efeito do tratamento com MSCs no reparo da lesão. Espera-se que a análise combinada, no mesmo sistema experimental, do nicho e potencial de resposta das diferentes populações celulares, permita a identificação de elementos com maior potencial terapêutico e seus mecanismos de ação, o que permitirá o desenho de protocolos clínicos de terapia celular menos empíricos e com maior fundamentação experimental.
Os múltiplos estudos básicos, pré-clínicos e clínicos com emprego de células-tronco adultas restringem-se, em sua grande maioria, à administração de células tais como a fração mononuclear da medula óssea ou subpopulações mais purificadas, como as células-tronco mesenquimais, e à avaliação dos resultados em termos de correção da lesão. Esses estudos, que podemos chamar de “tipo início-e-fim”, ignoram os elementos e eventos presentes tanto na lesão quanto nas células administradas, e que são responsáveis pelo resultado final do procedimento.
Um dos pontos que exigem maior atenção, para melhor compreensão da biologia das CT adultas, é a questão do nicho. As células-tronco têm seu comportamento determinado por interações com seu micro-ambiente, ou nicho, que é composto por outras células, matriz extra-celular e fatores de sinalização. Estas interações determinam se a célula permanecerá quiescente ou entrará em mitose, originando neste caso outra CT e/ou progenitores comprometidos com a diferenciação. Este conceito é fundamental tanto para estudos básicos envolvendo a manutenção das CTs durante o cultivo in vitro, que exige a reprodução tão fiel quanto possível do nicho fisiológico, quanto para seu emprego em procedimentos terapêuticos. Se o tecido alvo não constituir uma “lesão adequada”, as células não o reconhecerão como nicho para aí exercerem sua funções de reparo. Assim, tão ou talvez mais importante que conhecer as células a serem terapeuticamente empregadas, é conhecer o sítio da lesão a ser corrigida.
O termo “nicho regenerativo” tem sido utilizado para descrever o conjunto de células presentes em um tecido lesado. Apesar de produzir fatores que visam atrair células regenerativas, o sítio da lesão representa também um microambiente hostil, necrótico ou isquêmico, que pode comprometer a sobrevivência de células transplantadas. Assim, a compreensão dos elementos e eventos aí atuantes é fundamental para o sucesso da intervenção.
Enquanto no cenário clínico outras análises são limitadas, em estudos pré-clínicos com emprego de modelos animais é possível avaliar a distribuição das células transplantadas e os mecanismos responsáveis pelo reparo. Ainda assim, estes pontos têm sido insuficientemente explorados. Como resultado, sabe-se muito pouco sobre os eventos celulares e moleculares que ocorrem no sítio da lesão e nas populações de células-tronco administradas. Este desconhecimento impede o desenho mais racional e eficiente de intervenções terapêuticas, que permanecem eminentemente empíricas.
O presente projeto propõe contribuir para esta definição, através do mapeamento detalhado dos eventos celulares e moleculares envolvidos em lesões teciduais em modelos murinos, e do potencial de resposta de células-tronco adultas murinas e humanas a estes elementos. Os modelos selecionados envolvem o infarto agudo do miocárdio e isquemia periférica, situações já bastante exploradas em estudos de terapia com células-tronco do tipo “início-e-fim” e, por esta mesma razão, adequadas para exploração em nível mais aprofundado.
O projeto envolve um grande grupo de pesquisadores, para adequada divisão das múltiplas tarefas conforme a infra-estrutura dos laboratórios e experiência dos participantes. A abordagem experimental envolve, basicamente, a produção cirúrgica das lesões em camundongos C57BL/6 e a análise detalhada e completa dos elementos presentes no nicho regenerativo, sempre em comparação ao tecido sadio. Para isto, serão produzidos cortes seriados para análise da morfologia, imunofenótipo, grau de proliferação e de apoptose das células dos sítios de lesão, e padrões de citocinas e fatores de crescimento produzidos. Análises destes tecidos por RT-PCR em tempo real informarão sobre perfis de expressão gênica. Identificando-se sinais e perfis mais interessantes em termos de regeneração tecidual, populações de células-tronco murinas e humanas serão avaliadas para seu potencial de resposta aos mesmos.
Serão analisadas a fração mononuclear da medula óssea humana e murina e populações purificadas de células-tronco mesenquimais, obtidas de medula óssea humana e da medula óssea, fígado, pulmão e rins de camundongos C57BL/6 GFP-positivos. As análises incluirão perfis de expressão gênica, produção de ligantes correspondentes aos principais sinais emitidos pelo sítio da lesão, características básicas e cariótipo das culturas de MSCs, padrão de distribuição das células murinas no nicho regenerativo após administração in situ ou sistêmica no modelo murino de IAM ou DAP, e efeito do tratamento com MSCs no reparo da lesão. Espera-se que a análise combinada, no mesmo sistema experimental, do nicho e potencial de resposta das diferentes populações celulares, permita a identificação de elementos com maior potencial terapêutico e seus mecanismos de ação, o que permitirá o desenho de protocolos clínicos de terapia celular menos empíricos e com maior fundamentação experimental.
Pesquisador: Niels Olsen Saraiva Câmara/ Instituto: USP-SP
Células-tronco mesenquimais adultas na regeneração e reparo em de lesões renais agudos e crônicos: papel da interação com o sistema imune e da inibição da transição epitélio-mesenquimal
Nos últimos anos, nosso grupo vem desenvolvendo pesquisas para caracterizar a resposta inflamatória presente em algumas doenças renais em modelos específicos experimentais e em seres humanos. As doenças renais apresentam enorme impacto social e econômico com grande morbi-mortalidade para os pacientes. Desta forma, as aquisições de novos conhecimentos que fortaleçam os conhecimentos sobre a fisiopatogenia destas doenças, e o descobrimento de novas estratégias que melhorem a disfunção renal tornam-se necessárias para melhorar a sobrevida dos pacientes.
As células-tronco possuem um grande potencial terapêutico que justificam as inúmeras pesquisas nesta área. Em especial, as células-tronco mesenquimais têm características que permitem a sua utilização em protocolos clínicos, como a imunomodulação e a menor alogenicidade. Utilizando o modelo de lesão por isquemia e reperfusão (IRI), nosso laboratório demonstrou que o tratamento com células-tronco mesenquimais de medula ósseas e progenitores neurais (neuroesferas) era capaz de reverter a disfunção renal. Estas células reduziam a inflamação tecidual por alterar o padrão de resposta imune, de Th1 (pró-inflamatório) para Th2 (anti-inflamatório). Entretanto, os mecanismos por detrás desta modulação da resposta imune permanecem desconhecidos. Aqui, neste novo projeto, nós formulamos uma hipótese de a ativação das células-tronco mesenquimais por moléculas específicas induz a secreção de fatores tróficos.
A capacidade destas células de polarizar precocemente a resposta imune para um padrão Th2, seria crucial na regeneração tecidual. Além disso, dados preliminares do nosso grupo demonstram que estas células também reduzem a fibrose renal num modelo de rim remanescente, sugerindo que a modulação da resposta imune agudamente possa ser benéfica em limitar a esclerose tecidual. Hoje, sabe-se que a fibrose túbulo-intersticial é resultado de um processo orquestrado denominado de transição epitélio-mesenquimal (TEM). Assim, nós também acreditamos que as células-tronco mesenquimais possam reverter ou limitar o dano fibrótico por interferir com a TEM, induzindo dediferenciação dos fibroblastos.
Neste projeto, nós pretendemos aprofundar os mecanismos imunológicos relacionados à regeneração de lesões renais, em diferentes modelos de lesão celular in vitro pelas células-tronco. Mais ainda, queremos estender nossas observações para modelos de lesão renal crônica, ao demonstrar que estas células podem modular a TEM, aspecto totalmente inovador na literatura. Nós trabalharemos com modelos estabelecidos de lesão renal aguda e crônica e com metodologia de biologia celular e molecular para responder aos nossos objetivos e às hipóteses levantadas. Esperamos que todos os dados gerados sejam publicados e que facilitem uma tradução clínica mais rápida, caso fique demonstrado o mecanismo, a segurança e reprodutibilidade dos resultados.
As células-tronco possuem um grande potencial terapêutico que justificam as inúmeras pesquisas nesta área. Em especial, as células-tronco mesenquimais têm características que permitem a sua utilização em protocolos clínicos, como a imunomodulação e a menor alogenicidade. Utilizando o modelo de lesão por isquemia e reperfusão (IRI), nosso laboratório demonstrou que o tratamento com células-tronco mesenquimais de medula ósseas e progenitores neurais (neuroesferas) era capaz de reverter a disfunção renal. Estas células reduziam a inflamação tecidual por alterar o padrão de resposta imune, de Th1 (pró-inflamatório) para Th2 (anti-inflamatório). Entretanto, os mecanismos por detrás desta modulação da resposta imune permanecem desconhecidos. Aqui, neste novo projeto, nós formulamos uma hipótese de a ativação das células-tronco mesenquimais por moléculas específicas induz a secreção de fatores tróficos.
A capacidade destas células de polarizar precocemente a resposta imune para um padrão Th2, seria crucial na regeneração tecidual. Além disso, dados preliminares do nosso grupo demonstram que estas células também reduzem a fibrose renal num modelo de rim remanescente, sugerindo que a modulação da resposta imune agudamente possa ser benéfica em limitar a esclerose tecidual. Hoje, sabe-se que a fibrose túbulo-intersticial é resultado de um processo orquestrado denominado de transição epitélio-mesenquimal (TEM). Assim, nós também acreditamos que as células-tronco mesenquimais possam reverter ou limitar o dano fibrótico por interferir com a TEM, induzindo dediferenciação dos fibroblastos.
Neste projeto, nós pretendemos aprofundar os mecanismos imunológicos relacionados à regeneração de lesões renais, em diferentes modelos de lesão celular in vitro pelas células-tronco. Mais ainda, queremos estender nossas observações para modelos de lesão renal crônica, ao demonstrar que estas células podem modular a TEM, aspecto totalmente inovador na literatura. Nós trabalharemos com modelos estabelecidos de lesão renal aguda e crônica e com metodologia de biologia celular e molecular para responder aos nossos objetivos e às hipóteses levantadas. Esperamos que todos os dados gerados sejam publicados e que facilitem uma tradução clínica mais rápida, caso fique demonstrado o mecanismo, a segurança e reprodutibilidade dos resultados.
Pesquisador: Oswaldo Tadeu Greco / Instituto: IMC
Terapia celular: Alternativa no tratamento de patologias clínicas refratárias à terapia convencional
As doenças cardiovasculares são responsáveis pela maior mortalidade no momento em todo o mundo e, pelas estatísticas, o Brasil deverá ter este índice em crescimento acentuado nestes próximos 10 anos.
A incidência cada vez maior dos fatores de risco nas coronariopatias, fatalmente esta etiologia será aquele que maior contribuirá para aumento deste índice.
Mesmo com os avanços na área farmacológica e nos procedimentos cirúrgicos, as lesões vasculares sem resposta à estas condutas, mesmo com o crescimento dos métodos invasivos, a disfunção ventricular tem aumentado significativamente.
Por isto, acredito que a medicina regenerativa, com implante de células-tronco autólogas, vem se apresentando como uma boa alternativa terapêutica para reparar este miocárdio muito danificado.
A literatura já vem mostrando estudos clínicos e pré-clinicos que esta conduta, tanto na área cardiológica, como em pneumopatias clinicas e isquemia critica de membros inferiores, tem sido uma possibilidade terapêutica a se pensar em casos sem resposta à conduta convencional.
A incidência cada vez maior dos fatores de risco nas coronariopatias, fatalmente esta etiologia será aquele que maior contribuirá para aumento deste índice.
Mesmo com os avanços na área farmacológica e nos procedimentos cirúrgicos, as lesões vasculares sem resposta à estas condutas, mesmo com o crescimento dos métodos invasivos, a disfunção ventricular tem aumentado significativamente.
Por isto, acredito que a medicina regenerativa, com implante de células-tronco autólogas, vem se apresentando como uma boa alternativa terapêutica para reparar este miocárdio muito danificado.
A literatura já vem mostrando estudos clínicos e pré-clinicos que esta conduta, tanto na área cardiológica, como em pneumopatias clinicas e isquemia critica de membros inferiores, tem sido uma possibilidade terapêutica a se pensar em casos sem resposta à conduta convencional.
Pesquisador: Oswaldo Keith Okamoto / Instituto: UNIFESP-SP
Inibição da propriedade tumorigênica de células-tronco embrionárias humanas por silenciamento gênico
Este projeto de pesquisa científica aborda um importante aspecto de biossegurança ainda não resolvido no campo da terapia celular e de crítica relevância para o avanço das aplicações clínicas com células-tronco: a formação de tumores. Trata-se de um problema pertinente a qualquer tipo de células-tronco. Não obstante, dada a marcante associação entre as propriedades de pluripotência e tumorigênese, este projeto adotará como modelo de estudo linhagens pré-estabelecidas de células-tronco embrionárias humanas (CTEh), disponíveis ao grupo para uso em pesquisa básica.
Estudos recentes do nosso grupo identificaram genes com expressão aberrante em células-tronco neoplásicas. Dois desses genes, E2F2 e MELK, estão envolvidos no controle do ciclo celular e do desenvolvimento embrionário de mamíferos. Estudos realizados por grupos independentes indicam que E2F2 e MELK regulam positivamente a expressão de outros genes com relevante função no processo de auto-renovação de células-tronco, desenvolvimento embrionário e transformação neoplásica, incluindo os genes Bmi-1, c-Myc e b-Myb. Portanto, testaremos se a repressão concomitante dos genes E2F2 e MELK é capaz de reduzir a proliferação de CTEh e a conseqüente formação de teratomas, com base em seus efeitos diretos (sobre o ciclo celular) e indiretos (conseqüente inibição da expressão de diversos oncogenes-alvo da rede transcricional controlada pelo E2F2 e oncogenes regulados pela via de sinalização de MELK).
Para este fim, testaremos o silenciamento dos genes E2F2 e MELK utilizando um sistema transiente de interferência de RNA (RNAi), evitando assim modificações permanentes ou descontroladas no genoma que possam inserir novas mutações e favorecer a transformação maligna. Uma repressão transitória desses genes seria adequada para conter as primeiras etapas envolvidas na tumorigênese de CTEh, até que os programas moleculares envolvidos em sua proliferação sejam naturalmente desligados na presença de estímulos para diferenciação celular. Nesse contexto, uma importante exterioridade do projeto diz respeito à aplicação de recursos nanobiotecnológicos almejando maior eficiência e menor toxicidade no processo de transfecção de CTEh. Busca-se, idealmente, uma condição de inibição tumorigênica que não comprometa a viabilidade e a pluripotência de CTEh. Esse aspecto será avaliado por ensaios de proliferação, invasão e diferenciação celular tanto in vitro quanto in vivo, estes últimos baseados em modelos de xenoimplantes ectópicos e ortotópicos para avaliação de formação de teratomas e diferenciação neural.
A pergunta científica deste projeto é de grande abrangência e com implicações imediatas no campo da terapia celular. Estudos nessa linha poderiam viabilizar a aplicação de diferentes tipos de células-tronco, incluindo as recém caracterizadas células iPS (induced pluripotent stem cells), em doenças carentes de tratamento efetivo. O conhecimento acerca da supressão de tumorigênese de células-tronco normais também teria implicações no combate às células-tronco neoplásicas, com vistas ao desenvolvimento de tratamentos mais efetivos para o câncer.
Estudos recentes do nosso grupo identificaram genes com expressão aberrante em células-tronco neoplásicas. Dois desses genes, E2F2 e MELK, estão envolvidos no controle do ciclo celular e do desenvolvimento embrionário de mamíferos. Estudos realizados por grupos independentes indicam que E2F2 e MELK regulam positivamente a expressão de outros genes com relevante função no processo de auto-renovação de células-tronco, desenvolvimento embrionário e transformação neoplásica, incluindo os genes Bmi-1, c-Myc e b-Myb. Portanto, testaremos se a repressão concomitante dos genes E2F2 e MELK é capaz de reduzir a proliferação de CTEh e a conseqüente formação de teratomas, com base em seus efeitos diretos (sobre o ciclo celular) e indiretos (conseqüente inibição da expressão de diversos oncogenes-alvo da rede transcricional controlada pelo E2F2 e oncogenes regulados pela via de sinalização de MELK).
Para este fim, testaremos o silenciamento dos genes E2F2 e MELK utilizando um sistema transiente de interferência de RNA (RNAi), evitando assim modificações permanentes ou descontroladas no genoma que possam inserir novas mutações e favorecer a transformação maligna. Uma repressão transitória desses genes seria adequada para conter as primeiras etapas envolvidas na tumorigênese de CTEh, até que os programas moleculares envolvidos em sua proliferação sejam naturalmente desligados na presença de estímulos para diferenciação celular. Nesse contexto, uma importante exterioridade do projeto diz respeito à aplicação de recursos nanobiotecnológicos almejando maior eficiência e menor toxicidade no processo de transfecção de CTEh. Busca-se, idealmente, uma condição de inibição tumorigênica que não comprometa a viabilidade e a pluripotência de CTEh. Esse aspecto será avaliado por ensaios de proliferação, invasão e diferenciação celular tanto in vitro quanto in vivo, estes últimos baseados em modelos de xenoimplantes ectópicos e ortotópicos para avaliação de formação de teratomas e diferenciação neural.
A pergunta científica deste projeto é de grande abrangência e com implicações imediatas no campo da terapia celular. Estudos nessa linha poderiam viabilizar a aplicação de diferentes tipos de células-tronco, incluindo as recém caracterizadas células iPS (induced pluripotent stem cells), em doenças carentes de tratamento efetivo. O conhecimento acerca da supressão de tumorigênese de células-tronco normais também teria implicações no combate às células-tronco neoplásicas, com vistas ao desenvolvimento de tratamentos mais efetivos para o câncer.
Pesquisador: Patricia Pranke / Instituto: UFRGS
Utilização de células-tronco na regeneração tecidual no reparo de tecidos removido no tratamento de câncer de laringe e para a regeneração óssea
As terapias celulares a partir do emprego de células-tronco mesenquimais (CTMs) passaram a representar uma alternativa de tratamento em diversas áreas da medicina. O câncer da laringe, especialmente aqueles em estadio mais avançado, determina um procedimento cirúrgico radical que compromete amplamente a qualidade de vida do indivíduo. A combinação de biomaterias com células-tronco representa uma estratégia promissora para a regeneração óssea.
O presente estudo visa utilizar CTMs provenientes de duas fontes não invasivas e de fácil acesso: a polpa dos dentes decíduos e o cordão umbilical, bem como sua aplicação na regeneração tecidual. As CTMs, associadas a biomateriais, serão usadas para promover a regeneração óssea e de tecido da laringe, em modelos animais. O projeto objetica a promoção da regeneração óssea em modelos de ratos e na recuperação do tecido perdido após a laringectomia em modelo de porcos.
Pesquisador: Patricia Rieken Macedo Rocco/ Instituto: UFRJ - RJ
Terapias celulares de doenças pulmonares e renais prevalentes: entendendo os mecanismos celulares e moleculares
O emprego de terapias celulares em doenças cardiovasculares (Tura et al., 2007) e neurológicas (Mendez-Otero et al., 2007) apresenta horizontes promissores no Brasil e o mesmo parece se delinear no caso de diabetes mellitus (Voltarelli et al., 2007). Todavia, apesar da alta prevalência, gravidade e custo social das doenças crônicas pulmonares e renais, bem como das poucas alternativas terapêuticas (incluindo o transplante alogênico), a utilização de terapias celulares nestas moléstias necessita ser melhor estudada. A presente proposta tem como objetivo central investigar se a terapia com células-tronco derivadas de medula óssea constitui uma opção viável e segura no tratamento de doenças pulmonares e renais de alta prevalência; focalizando esforços para entendimento dos aspectos celulares e moleculares das interações destas células com o tecido lesado e se propondo a estabelecer modelos de aplicação terapêutica. Ademais, será iniciada a Fase I de terapia celular em pacientes com silicose (projeto já testado em modelos animais por nossa equipe e aprovado pelo CONEP para aplicação em seres humanos). Para tal, 22 pesquisadores (12 laboratórios, 6 Unidades de 3 Instituições de Pesquisa) se consorciaram no presente edital do CNPq (Edital CT-Saúde/MS/SCTIE/DECIT/MCT/CNPq Nº 17/2008), reeditando uma associação de dois anos que implicou na criação de uma atmosfera de pesquisa altamente colaborativa e na otimização do uso de instalações e equipamentos comuns.
Pesquisador: Paulo Roberto Slud Brofman/ Instituto: PUC - PR
Estudo in vitro e in vivo da capacidade pro-angiogênica das células-tronco mesenquimais e celulas progenitoras endoteliais humanas tratadas com doador de oxido nítrico
Dentre as doenças cardiovasculares, o infarto agudo do miocárdio, é a principal causa de óbito na população mundial. Apesar dos avanços clínicos e cirúrgicos constitui-se, ainda, um grave problema de saúde pública. Após infarto, o miocárdio espontaneamente tenta regenerar o tecido danificado, por mobilização e migração endógena de diferentes tipos celulares por vias específicas, envolvendo citocinas, alterações na matriz extracelular e moléculas de adesão, porém estas ações não são suficientes para a melhora funcional. Além disso, nenhuma medicação ou procedimento utilizado clinicamente tem demonstrado eficácia na substituição da cicatriz do infarto por tecido funcional. Devido a estes fatores surgiu a necessidade do desenvolvimento de novas opções terapêuticas para reparar o miocárdio lesado.
Nesse contexto surge a terapia celular com o objetivo de utilizar células-tronco no tratamento de doenças cardiovasculares. Vários estudos pré-clínicos e clínicos têm demonstrado resultados promissores desta estratégia terapêutica no tratamento destas graves doenças.
Em especial as células progenitoras endoteliais e as células-tronco mesenquimais têm se mostrado importantes reguladoras no processo de reparo tecidual, na formação de novos vasos e na regeneração de regiões isquêmicas.
Estudos demonstraram que o tratamento das células-tronco mesenquimais com óxido nítrico leva ao aumento da expressão do fator de crescimento endotelial vascular, o qual é considerado um regulador central da angiogênese, tanto em condições fisiológicas quanto patológicas por exercer uma função predominante na neovascularização, e na diferenciação em células endoteliais.
A hipótese deste trabalho é que o tratamento das células-tronco mesenquimais com óxido nítrico aumente a capacidade parácrina pró-angiogênica e possivelmente a diferenciação destas e das progenitoras endoteliais em células endoteliais. Assim, co-transplantes de células-tronco mesenquimais tratadas com óxido nítrico e células progenitoras endoteliais terão um efeito benéfico maior que transplantes de culturas individuais não-tratadas.
Nesse contexto surge a terapia celular com o objetivo de utilizar células-tronco no tratamento de doenças cardiovasculares. Vários estudos pré-clínicos e clínicos têm demonstrado resultados promissores desta estratégia terapêutica no tratamento destas graves doenças.
Em especial as células progenitoras endoteliais e as células-tronco mesenquimais têm se mostrado importantes reguladoras no processo de reparo tecidual, na formação de novos vasos e na regeneração de regiões isquêmicas.
Estudos demonstraram que o tratamento das células-tronco mesenquimais com óxido nítrico leva ao aumento da expressão do fator de crescimento endotelial vascular, o qual é considerado um regulador central da angiogênese, tanto em condições fisiológicas quanto patológicas por exercer uma função predominante na neovascularização, e na diferenciação em células endoteliais.
A hipótese deste trabalho é que o tratamento das células-tronco mesenquimais com óxido nítrico aumente a capacidade parácrina pró-angiogênica e possivelmente a diferenciação destas e das progenitoras endoteliais em células endoteliais. Assim, co-transplantes de células-tronco mesenquimais tratadas com óxido nítrico e células progenitoras endoteliais terão um efeito benéfico maior que transplantes de culturas individuais não-tratadas.
Pesquisador: Radovan Borojevic/ Instituto: UFRJ - RJ
Diferenciação in vitro de cardiomiócitos a partir de células-tronco mesenquimais: Inducão programada da expressão gênica
As terapias celulares e a bioengenharia de tecido de miocárdio são novas propostas para tratamento de cardiopatias isquêmicas e degenerativas. Na maioria dos protocolos em estudo, as células usadas são derivadas da medula óssea, que podem estimular a regeneração por via parácrina e/ou participar na formação de novo miocárdio pela transdiferenciação. Ambos os processos são aleatórios e de difícil controle. A introdução de novos cardiomiócitos, injetados ou implantados com biomateriais em construções de bioengenharia, necessitam uma fonte de cardiomiócitos. Vários estudos trabalham com cardiomiócitos derivados de células embrionárias. Além dos problemas da instabilidade e tendência de formação de teratocarcinomas, tratam-se de células alogenéicas causando a resposta imune anti-enxerto.
A nossa proposta visa desenvolver a tecnologia de produção em massa de cardiomiócitos humanos. A fonte celular serão as células-tronco mesenquimais, derivadas da medula óssea ou de tecido adiposo subcutâneo do próprio paciente. Esta opção permite o uso de células autólogas em tratamento de lesões do miocárdio. A expressão do fenótipo cardiomiocítico será induzida pela introdução seqüencial, combinatória e programada de genes por transfecção de plasmidios portadores de genes selecionados. A sua expressão é limitada no tempo, e não se integram no genoma da célula manipulada. No início, a introdução de genes dominantes em células embrionárias reverterá a diferenciação tecido-específica de progenitores mesenquimais, gerando as células pluripotentes induzidas a partir de células adultas (IPC). Em seguida, induziremos a expressão dos genes-master que determinam o comprometimento e a expressão completa na via de diferenciação em cardiomiócitos, seguindo a ordem da ativação destes genes no desenvolvimento embrionário. O uso complementar de fatores de crescimento adequados a cada um dos estágios de diferenciação será estudado. Procuraremos otimizar o processo para torná-lo viável em uso clínico, e verificar in vitro a geração estrutural e funcional de cardiomiócitos usados potencialmente em tratamento de cardiopatias.
A nossa proposta visa desenvolver a tecnologia de produção em massa de cardiomiócitos humanos. A fonte celular serão as células-tronco mesenquimais, derivadas da medula óssea ou de tecido adiposo subcutâneo do próprio paciente. Esta opção permite o uso de células autólogas em tratamento de lesões do miocárdio. A expressão do fenótipo cardiomiocítico será induzida pela introdução seqüencial, combinatória e programada de genes por transfecção de plasmidios portadores de genes selecionados. A sua expressão é limitada no tempo, e não se integram no genoma da célula manipulada. No início, a introdução de genes dominantes em células embrionárias reverterá a diferenciação tecido-específica de progenitores mesenquimais, gerando as células pluripotentes induzidas a partir de células adultas (IPC). Em seguida, induziremos a expressão dos genes-master que determinam o comprometimento e a expressão completa na via de diferenciação em cardiomiócitos, seguindo a ordem da ativação destes genes no desenvolvimento embrionário. O uso complementar de fatores de crescimento adequados a cada um dos estágios de diferenciação será estudado. Procuraremos otimizar o processo para torná-lo viável em uso clínico, e verificar in vitro a geração estrutural e funcional de cardiomiócitos usados potencialmente em tratamento de cardiopatias.
Pesquisador: Rafael Linden/ Instituto: UFRJ - RJ
Mecanismos de controle do ciclo celular de células-tronco embrionárias
Este projeto destina-se a examinar os componentes e mecanismos de controle do ciclo celular na linhagem de células-tronco embrionárias, indiferenciada ou comprometida em progenitores neurais, que podem determinar suas características fenotípicas, de forma a compreender o comportamento destas células. Além disso, pretendemos analisar o que ocorre no ciclo celular com a inibição da proliferação por expressão dos genes supressores de tumor p16INK4A e p21CIP e pelo processo de indução de diferenciação das células-tronco embrionárias em fotorreceptores pela expressão dos genes nrl, otx2 e crx, visando a utilização futura destas células em ensaios pré-clínicos em modelo murino de retinose pigmentar (camundongos C3Hrd1).
Pesquisador: Ricardo Ferreira Bento/ Instituto: USP-SP
Sinalização e diferenciação das células do órgão de Corti: perspectivas para a terapia da surdez
A maioria das perdas auditivas, adquiridas ou congênitas, decorre da perda irreversível das células ciliadas cocleares ou de seus neurônios. A irreversibilidade da surdez em mamíferos se deve à incapacidade de substituição das células perdidas, seja por ausência de retorno ao ciclo celular ou de trans-diferenciação do epitélio da orelha interna. Clinicamente, a função das células ciliadas perdidas pode ser parcialmente compensada por estimulação elétrica do nervo auditivo, através dos implantes cocleares. No entanto, outras alternativas terapêuticas com bases moleculares e celulares precisam ser exploradas procurando melhorar a função auditiva e qualidade de vida do paciente surdo. Em virtude da irreversibilidade da maior parte dos quadros de surdez, tem-se buscado desvendar os mecanismos moleculares e celulares relacionados à fisiologia da audição e, consequentemente, à sua perda.
Este projeto de pesquisa compreende o desenvolvimento de metodologias de investigação sobre a audição com os seguintes objetivos: (i) padronizar procedimentos de obtenção e reintrodução de células no órgão de Corti, em especial das precursoras de células epiteliais, ciliadas; e (ii) padronizar procedimentos de modificação genética e funcional de células cultivadas do órgão de Corti. Com esses objetivos, a longo prazo, pretendemos criar condições experimentais fundamentais ao desenvolvimento de estratégias futuras de terapia celular e terapia gênica na deficiência auditiva.
Este projeto de pesquisa compreende o desenvolvimento de metodologias de investigação sobre a audição com os seguintes objetivos: (i) padronizar procedimentos de obtenção e reintrodução de células no órgão de Corti, em especial das precursoras de células epiteliais, ciliadas; e (ii) padronizar procedimentos de modificação genética e funcional de células cultivadas do órgão de Corti. Com esses objetivos, a longo prazo, pretendemos criar condições experimentais fundamentais ao desenvolvimento de estratégias futuras de terapia celular e terapia gênica na deficiência auditiva.
Pesquisador: Ricardo Ribeiro dos Santos/ Instituto: FIOCRUZ - RJ
Terapia celular pelo transplante autólogo de células-tronco de medula óssea em pacientes com trauma raquimedular
No momento não há nenhum tratamento eficaz para a recuperação da medula espinhal lesionada. Com base em dados experimentais do nosso grupo em cães e gatos com lesões completas de medula espinhal, que indicaram a segurança e eficácia do transplante de células-tronco mesenquimais da medula óssea autóloga neste tipo de lesão, o presente projeto propõe a investigação desta terapia em pacientes com lesões raquimedulares com mais de 6 meses de evolução, para os quais não se pode oferecer no momento nenhuma terapêutica capaz de reverter este quadro.
Com base em dados experimentais do nosso grupo em cães e gatos com lesões completas de medula espinhal, que indicaram a segurança e eficácia do transplante de células-tronco mesenquimais da medula óssea autóloga neste tipo de lesão, o presente projeto propõe a investigação desta terapia em pacientes com lesões raquimedulares com mais de 6 meses de evolução, para os quais não se pode oferecer no momento nenhuma terapêutica capaz de reverter este quadro.
Será realizado um estudo clínico de fase I objetivo investigar se a administração de células-tronco mesenquimais da medula óssea autólogas é segura e causa o reparo da medula espinhal quando injetadas na área de lesão em 20 pacientes com trauma raquimedular, lesões completas (Frankel A) crônicas. A potencial eficácia do método será avaliada através da avaliação da melhora funcional (clínica, por ressonância nuclear magnética e por avaliação do potencial evocado).
Os pacientes serão submetidos à avaliação técnica de toda a estrutura músculo articular, presença de contraturas e hiperreflexia, controle de esfíncter e bexiga antes do procedimento. Após o procedimento cirúrgico, o paciente será submetido a um protocolo diário de fisioterapia. Esperamos, com a realização deste estudo, contribuir para o desenvolvimento de novas terapias baseadas no transplante celular para o tratamento de lesões raquimedulares crônicas
Com base em dados experimentais do nosso grupo em cães e gatos com lesões completas de medula espinhal, que indicaram a segurança e eficácia do transplante de células-tronco mesenquimais da medula óssea autóloga neste tipo de lesão, o presente projeto propõe a investigação desta terapia em pacientes com lesões raquimedulares com mais de 6 meses de evolução, para os quais não se pode oferecer no momento nenhuma terapêutica capaz de reverter este quadro.
Será realizado um estudo clínico de fase I objetivo investigar se a administração de células-tronco mesenquimais da medula óssea autólogas é segura e causa o reparo da medula espinhal quando injetadas na área de lesão em 20 pacientes com trauma raquimedular, lesões completas (Frankel A) crônicas. A potencial eficácia do método será avaliada através da avaliação da melhora funcional (clínica, por ressonância nuclear magnética e por avaliação do potencial evocado).
Os pacientes serão submetidos à avaliação técnica de toda a estrutura músculo articular, presença de contraturas e hiperreflexia, controle de esfíncter e bexiga antes do procedimento. Após o procedimento cirúrgico, o paciente será submetido a um protocolo diário de fisioterapia. Esperamos, com a realização deste estudo, contribuir para o desenvolvimento de novas terapias baseadas no transplante celular para o tratamento de lesões raquimedulares crônicas
Pesquisador: Roberta Ferro de Godoy/ Instituto: UNB-DF
Células-tronco na regeneração do nervo ulnar de equinos
A presente investigação científica tem como propósito verificar a regeneração dos nervos ulnares após neurotomia e aplicação de células-tronco em fêmeas eqüinas após procedimento cirúrgico, comparando a técnica convencional de sutura do epineuro com a aplicação de tubos de silicone com deposição de células-tronco na regeneração de nervos ulnares seccionados. O procedimento será avaliado quantificando-se por meio de exame histopatológico e histomorfométrico as alterações patológicas do local cirúrgico e a regeneração nervosa periférica, após sutura convencional e deposição de células-tronco entre nervos ulnares seccionados de fêmeas eqüinas sem raça definida. Determinar ainda por meio da técnica de imunoistoquímica, o crescimento axonal e a formação da bainha de mielina pela expressão das proteínas S-100 e neurofilamento em nervos ulnares após secção e sutura convencional ou deposição de células-tronco em equinos. E avaliar ainda por meio de exames clínicos específicos do aparelho locomotor, a recuperação sensitiva e motora dos membros torácicos e do local cirúrgico da secção dos nervos ulnares, após tratamento. Possibilitando assim verificar a eficácia do emprego de células-tronco na regeneração nervosa periférica em eqüinos.
Pesquisador: Rosalia Mendez-Otero/ Instituto: UFRJ - RJ
Terapia Celular em Modelos Animais de Doenças Neurológicas: estudos básicos e pré-clínicos.
As doenças neurológicas figuram entre as de maior prevalência e mortalidade em paises desenvolvidos e em desenvolvimento. Em países como os Estados Unidos calcula-se que o custo econômico anual em despesas médicas e perda de produtividade decorrentes destas doenças é da ordem de centenas de bilhões de dólares. No Brasil, os dados publicados pelo SUS mostram que as doenças cérebro vasculares como acidentes vasculares cerebrais (AVC) isquêmicos e hemorrágicos constituem a maior causa de mortes no País por doença com aproximadamente 90.000 óbitos/ano. O custo para o Ministério da Saúde com esta doença foi da ordem de R$ 142 milhões apenas no ano de 2003. Embora as doenças neurológicas sejam bem conhecidas do ponto de vista clinico há muitos anos, os mecanismos envolvidos na patogênese da maioria delas ainda é pouco conhecido. Além disto, não há atualmente terapias farmacológicas eficazes para tratar estas doenças e os doentes que sobrevivem à lesão ou doença apresentam perdas funcionais permanentes e em geral altamente incapacitantes. Neste sentido, a comunidade científica vem se esforçando para descobrir novas abordagens que permitam um maior conhecimento sobre o Sistema Nervoso como um todo e que nos levem a terapias mais eficientes para tratar as doenças e lesões neurológicas.
Neste quadro, as células-tronco surgem como grandes alternativas e tem sido consideradas como possíveis terapias principalmente para tecidos que apresentam pequena capacidade de regeneração como é o caso do sistema nervoso do indivíduo adulto. Embora promissoras, muitas questões devem ser respondidas antes que as terapias celulares venham a fazer parte da prática clinica e no projeto que estamos propondo pretendemos contribuir para a solução de algumas estas questões como descrito abaixo.
A nossa hipótese de trabalho é a de que as células-tronco podem ser utilizadas em terapias celulares de doenças neurológicas seja substituindo células perdidas em lesões ou doenças seja aumentando a capacidade de regeneração existente dentro do próprio tecido nervoso neste caso atuando através de mecanismos de neuroproteção e/ou de neuroregeneração. O objetivo final destas terapias celulares é o de diminuir e/ou recuperar a perda funcional que ocorre após lesão do sistema nervoso do adulto.
As células-tronco podem ser obtidas de diversas fontes e apresentam características muito diferentes entre si. No momento, não se sabe qual seria o melhor tipo de célula-tronco a ser utilizada e em que doenças ou lesões neurológicas elas poderiam ter efeito terapêutico. É possível, que mais do que um tipo celular possa vir a ser utilizado com diferentes propósitos terapêuticos. Por exemplo, se o objetivo for o de substituir neurônios ou células gliais perdidas em uma determinada patologia as células-tronco embrionárias e/ou as células-tronco induzidas e/ou as células-tronco neurais poderão ser as de escolha uma vez que já se sabe que estas células tem a potencialidade de se diferenciarem em células do sistema nervoso (neurônios e glia).
Por outro lado, se o objetivo da terapia celular for o de aumentar a capacidade de regeneração do sistema nervoso e com isto diminuir a perda funcional, as células-tronco adultas (derivadas de medula óssea, de sangue de cordão umbilical ou de outros tecidos) poderão vir a ser utilizadas uma vez que estas células liberam uma série de fatores com propriedades de aumentar a vasculogênese, diminuir a morte celular, modular a inflamação e a regeneração tecidual. Todos estes efeitos contribuem para uma melhora funcional do tecido ou órgão que se quer tratar e portanto estas células tem um beneficio terapêutico.
Para que as diferentes células-tronco possam ser utilizadas de forma segura e eficaz é necessário que se conheçam, os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na manutenção do estado primitivo, e na indução da diferenciação destas células. É também necessário estudar processos que permitam a expansão in vitro de células-tronco humanas e de animais e os mecanismos de mobilização, migração e integração destas ou de linhagens após a diferenciação com o ambiente tecidual. Estes são assuntos que ainda não foram totalmente desvendados e estes temas serão abordados neste projeto com experimentos específicos.
Para abordar estes temas utilizaremos diferentes tipos de células-tronco (células-tronco embrionárias, células-tronco induzidas, células-tronco tecido especificas no caso células-tronco neurais células-tronco adultas derivadas de medula óssea e células-tronco derivadas de cordão umbilical). Estas populações celulares serão estudadas no que diz respeito a seu potencial de proliferação no estado indiferenciado e de diferenciação em células de sistema nervoso in vitro e in vivo. Estudos em andamento no nosso grupo e em outros indicam que células, embrionárias, células-tronco neurais e células-tronco induzidas poderão ser excelentes fontes de produção de células para o sistema nervoso desde que as questões de segurança ainda existentes possam ser resolvidas.
Por outro lado, os estudos em andamento no nosso grupo e em diversos laboratórios nos sugerem que células-tronco adultas (derivadas de medula óssea ou de sangue de cordão umbilical) não apresentam a capacidade de diferenciação em células do sistema nervoso embora possam vir a ter outras aplicações terapêuticas importantes através de ações parácrinas. Com os estudos in vitro e in vivo que estamos propondo pretendemos responder a estas perguntas.
Uma vez isoladas e caracterizadas as diferentes células-tronco devem ser estudadas em modelos animais de diferentes doenças neurológicas visando avaliar a segurança e eficácia destas terapias e os possíveis mecanismos de ação. Os modelos animais são limitados uma vez que várias das funções neurais afetadas por doenças neurológicas não estão presentes nestes animais e portanto o efeito de uma determinada terapia nem sempre pode ser inteiramente avaliado nestes modelos. Por outro, antes de se chegar a um estudo clínico diversos parâmetros devem e podem ser testados no modelo animal. Por exemplo, é fundamental investigar no modelo animal a mobilização, migração e integração com o ambiente tecidual dos diferentes tipos de células-tronco. Nestes modelos é possível ainda investigar vias de aplicação, doses, janelas terapêuticas e outros parâmetros que serão utilizados no estudo clínico. O mecanismo de ação das diferentes células em diferentes doenças também pode ser melhor investigado nos modelos animais e podem servir de substrato para o desenho dos estudos clínicos. Neste projeto utilizamos diversos modelos animais de leões e doenças neurológicas com o objetivo de investigar o possível papel terapêutico dos diferentes tipos de células-tronco. Os resultados obtidos nestes estudos pré-clínicos serão discutidos pelos colaboradores da área médica para futuro desenvolvimento por estas equipes e poderão vir a gerar protocolos clínicos.
Neste quadro, as células-tronco surgem como grandes alternativas e tem sido consideradas como possíveis terapias principalmente para tecidos que apresentam pequena capacidade de regeneração como é o caso do sistema nervoso do indivíduo adulto. Embora promissoras, muitas questões devem ser respondidas antes que as terapias celulares venham a fazer parte da prática clinica e no projeto que estamos propondo pretendemos contribuir para a solução de algumas estas questões como descrito abaixo.
A nossa hipótese de trabalho é a de que as células-tronco podem ser utilizadas em terapias celulares de doenças neurológicas seja substituindo células perdidas em lesões ou doenças seja aumentando a capacidade de regeneração existente dentro do próprio tecido nervoso neste caso atuando através de mecanismos de neuroproteção e/ou de neuroregeneração. O objetivo final destas terapias celulares é o de diminuir e/ou recuperar a perda funcional que ocorre após lesão do sistema nervoso do adulto.
As células-tronco podem ser obtidas de diversas fontes e apresentam características muito diferentes entre si. No momento, não se sabe qual seria o melhor tipo de célula-tronco a ser utilizada e em que doenças ou lesões neurológicas elas poderiam ter efeito terapêutico. É possível, que mais do que um tipo celular possa vir a ser utilizado com diferentes propósitos terapêuticos. Por exemplo, se o objetivo for o de substituir neurônios ou células gliais perdidas em uma determinada patologia as células-tronco embrionárias e/ou as células-tronco induzidas e/ou as células-tronco neurais poderão ser as de escolha uma vez que já se sabe que estas células tem a potencialidade de se diferenciarem em células do sistema nervoso (neurônios e glia).
Por outro lado, se o objetivo da terapia celular for o de aumentar a capacidade de regeneração do sistema nervoso e com isto diminuir a perda funcional, as células-tronco adultas (derivadas de medula óssea, de sangue de cordão umbilical ou de outros tecidos) poderão vir a ser utilizadas uma vez que estas células liberam uma série de fatores com propriedades de aumentar a vasculogênese, diminuir a morte celular, modular a inflamação e a regeneração tecidual. Todos estes efeitos contribuem para uma melhora funcional do tecido ou órgão que se quer tratar e portanto estas células tem um beneficio terapêutico.
Para que as diferentes células-tronco possam ser utilizadas de forma segura e eficaz é necessário que se conheçam, os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na manutenção do estado primitivo, e na indução da diferenciação destas células. É também necessário estudar processos que permitam a expansão in vitro de células-tronco humanas e de animais e os mecanismos de mobilização, migração e integração destas ou de linhagens após a diferenciação com o ambiente tecidual. Estes são assuntos que ainda não foram totalmente desvendados e estes temas serão abordados neste projeto com experimentos específicos.
Para abordar estes temas utilizaremos diferentes tipos de células-tronco (células-tronco embrionárias, células-tronco induzidas, células-tronco tecido especificas no caso células-tronco neurais células-tronco adultas derivadas de medula óssea e células-tronco derivadas de cordão umbilical). Estas populações celulares serão estudadas no que diz respeito a seu potencial de proliferação no estado indiferenciado e de diferenciação em células de sistema nervoso in vitro e in vivo. Estudos em andamento no nosso grupo e em outros indicam que células, embrionárias, células-tronco neurais e células-tronco induzidas poderão ser excelentes fontes de produção de células para o sistema nervoso desde que as questões de segurança ainda existentes possam ser resolvidas.
Por outro lado, os estudos em andamento no nosso grupo e em diversos laboratórios nos sugerem que células-tronco adultas (derivadas de medula óssea ou de sangue de cordão umbilical) não apresentam a capacidade de diferenciação em células do sistema nervoso embora possam vir a ter outras aplicações terapêuticas importantes através de ações parácrinas. Com os estudos in vitro e in vivo que estamos propondo pretendemos responder a estas perguntas.
Uma vez isoladas e caracterizadas as diferentes células-tronco devem ser estudadas em modelos animais de diferentes doenças neurológicas visando avaliar a segurança e eficácia destas terapias e os possíveis mecanismos de ação. Os modelos animais são limitados uma vez que várias das funções neurais afetadas por doenças neurológicas não estão presentes nestes animais e portanto o efeito de uma determinada terapia nem sempre pode ser inteiramente avaliado nestes modelos. Por outro, antes de se chegar a um estudo clínico diversos parâmetros devem e podem ser testados no modelo animal. Por exemplo, é fundamental investigar no modelo animal a mobilização, migração e integração com o ambiente tecidual dos diferentes tipos de células-tronco. Nestes modelos é possível ainda investigar vias de aplicação, doses, janelas terapêuticas e outros parâmetros que serão utilizados no estudo clínico. O mecanismo de ação das diferentes células em diferentes doenças também pode ser melhor investigado nos modelos animais e podem servir de substrato para o desenho dos estudos clínicos. Neste projeto utilizamos diversos modelos animais de leões e doenças neurológicas com o objetivo de investigar o possível papel terapêutico dos diferentes tipos de células-tronco. Os resultados obtidos nestes estudos pré-clínicos serão discutidos pelos colaboradores da área médica para futuro desenvolvimento por estas equipes e poderão vir a gerar protocolos clínicos.
Pesquisador: Rui Curi / Instituto: USP-SP
Efeito da Terapia com Células-Tronco Musculares e Células-Tronco Mesenquimais na Regeneração do Músculo Esqueletico: Possível Modulação por Ácidos Graxos.
A possibilidade de administrar um número maior de células e facilitar a regeneração tecidual representa um grande desafio no tratamento de lesões musculares graves como a laceração. Esse tipo de lesão apresenta regeneração incompleta e comprometimento significativo da função do músculo esquelético. Entretanto, essa melhora na recuperação de lesões devido à terapia celular tem sido atribuída à diversos mecanismos tais como: diferenciação das células-tronco em células do tecido lesionado, promoção de angiogênese, modulação de fenômenos inflamatórios e estimulação da regeneração espontânea do tecido através de mecanismos parácrinos. Neste estudo investigaremos o efeito dos ácidos graxos ômega 3, ômega 6 e ômega 9 nos mecanismo de proliferação e diferenciação de células-tronco musculares murinas e humanas in vitro e do transplante de células-tronco musculares e de células-tronco mesenquimais da medula óssea murinas na regeneração e recuperação da função do músculo esquelético após a laceração experimental. Para isto, estudaremos o efeito da terapia celular na expressão de marcadores moleculares de miogênese, angiogênese e fibrogênese em diversos períodos de tempos após a indução da lesão muscular em ratos singenêicos. O estudo será complementado com análises histológicas e teste de função muscular. Na segunda etapa do trabalho, investigaremos o possível papel modulador exercido pelos ácidos graxos no efeito da terapia celular, visto que há evidências do efeito benéfico de alguns ácidos graxos na diferenciação muscular in vitro.
Pesquisador: Samuel Goldenberg/ Instituto: ICC - PA
Análise epigênetica de células-tronco mesenquimais da medula óssea na indução adipogênica.
O potencial de diferenciação das células-troncos adultas é bem variável conforme a proveniência das células. Considerando o papel dos mecanismos epigenéticos na diferenciação celular, propomo-nos a investigar se existe um perfil epigenético que caracteriza um maior ou menor potencial de diferenciação adipogênica de células-tronco adultas. Ainda, tendo em vista que a organização espacial de genes isolados tem sido relacionada à sua atividade funcional, outra questão que levantamos é se a organização espacial de genes característicos da linhagem-alvo adipocítica e de genes tronco-específicos é modificada com a diferenciação das células-tronco adultas.
Para responder a estas perguntas, o modelo experimental proposto envolve a diferenciação adipogênica de células tronco mesenquimais isoladas da medula óssea, processo já estabelecido em nosso grupo, e análises epigenéticas, as quais consistem em análises de modificações de histonas e metilação de DNA. Assim poderemos estabelecer um perfil epigenético de genes tronco-específicos e de genes associados à linhagem-alvo adipocítica quanto a modificações (acetilações e metilações) nas histonas e metilação do DNA no decorrer do processo de diferenciação de culturas celulares com potencial adipogênico elevado e reduzido. A obtenção destes conhecimentos contribuirá para a compreensão dos mecanismos envolvidos na diferenciação de células-tronco adultas.
Para responder a estas perguntas, o modelo experimental proposto envolve a diferenciação adipogênica de células tronco mesenquimais isoladas da medula óssea, processo já estabelecido em nosso grupo, e análises epigenéticas, as quais consistem em análises de modificações de histonas e metilação de DNA. Assim poderemos estabelecer um perfil epigenético de genes tronco-específicos e de genes associados à linhagem-alvo adipocítica quanto a modificações (acetilações e metilações) nas histonas e metilação do DNA no decorrer do processo de diferenciação de culturas celulares com potencial adipogênico elevado e reduzido. A obtenção destes conhecimentos contribuirá para a compreensão dos mecanismos envolvidos na diferenciação de células-tronco adultas.
Pesquisador: Sara Teresinha Olalla Saad/ Instituto: UNICAMP - SP
Ação de células mesenquimais derivadas do tecido adiposo na regeneração de lesões cartilaginosas do joelho de coelhos.
A lesão da cartilagem hialina do joelho é um desafio à medicina contemporânea. Desde as primeiras descrições até a atualidade, é incontestável a incapacidade da cartilagem se reparar normalmente num processo de cicatrização espontâneo. É também um fato o insucesso das medidas terapêuticas adotadas para o seu tratamento, até o momento.
A engenharia de Tecidos pode ser uma resposta para este problema. Inúmeras pesquisas têm demonstrado a possibilidade de se obter cartilagem, com as mesmas características da cartilagem hialina, a partir de células mesenquimais. O desenvolvimento de métodos de obtenção destas células de diferentes fontes, algumas delas com material abundante, como as células adiposas obtidas na lipoaspiração, têm estimulado ainda mais estes estudos.
Outro aspecto relevante é a constatação que o desenvolvimento de arcabouços tridimensionais de colágeno e outras substâncias têm facilitado a formação do tecido cartilaginoso.
Neste projeto, a partir de modelo já estabelecido em nossa instituição, obteremos células mesenquimais a partir de células do tecido adiposo coletadas durante a lipoaspiração. Após sua diferenciação, esponjas de colágeno tipo II, obtidos com metodologia também desenvolvida no Faculdade de Medicina da Unicamp, no Laboratório de Medicina Molecular, serão embebidas com meio de cultura contendo estas células. Os complexos colágeno tipo II-célula mesenquimal, serão implantados em lesões cartilaginosas produzidas na area de carga do joelho de coelhos, para observarmos o padrão de regeneração obtida. O tecido obtido com complexo arcabouço de colágeno tipo II-célula mesenquimal (grupo 4) será comparado com os tecidos formados na cicatrização expontânea (grupo1), com colágeno tipo II (grupo2) e célula mesenquimal sem o arcabouço (grupo3). A orientação e agregação das fibras de colágeno da cartilagem hialina regenerada no joelho dos coelhos serão analisadas aatravés da técnica de Geração de Segundo Harmônico (SHC). O efeito do processo de congelamento com dimetilsulfóxido (DMSO) das células mesenquimais obtidas de tecido adiposo, submetidas pós descongelamento à diferenciação para linhagem condrogênica terá suas fibras de colágeno avaliadas através da técnica de Segundo Harmônico.
A engenharia de Tecidos pode ser uma resposta para este problema. Inúmeras pesquisas têm demonstrado a possibilidade de se obter cartilagem, com as mesmas características da cartilagem hialina, a partir de células mesenquimais. O desenvolvimento de métodos de obtenção destas células de diferentes fontes, algumas delas com material abundante, como as células adiposas obtidas na lipoaspiração, têm estimulado ainda mais estes estudos.
Outro aspecto relevante é a constatação que o desenvolvimento de arcabouços tridimensionais de colágeno e outras substâncias têm facilitado a formação do tecido cartilaginoso.
Neste projeto, a partir de modelo já estabelecido em nossa instituição, obteremos células mesenquimais a partir de células do tecido adiposo coletadas durante a lipoaspiração. Após sua diferenciação, esponjas de colágeno tipo II, obtidos com metodologia também desenvolvida no Faculdade de Medicina da Unicamp, no Laboratório de Medicina Molecular, serão embebidas com meio de cultura contendo estas células. Os complexos colágeno tipo II-célula mesenquimal, serão implantados em lesões cartilaginosas produzidas na area de carga do joelho de coelhos, para observarmos o padrão de regeneração obtida. O tecido obtido com complexo arcabouço de colágeno tipo II-célula mesenquimal (grupo 4) será comparado com os tecidos formados na cicatrização expontânea (grupo1), com colágeno tipo II (grupo2) e célula mesenquimal sem o arcabouço (grupo3). A orientação e agregação das fibras de colágeno da cartilagem hialina regenerada no joelho dos coelhos serão analisadas aatravés da técnica de Geração de Segundo Harmônico (SHC). O efeito do processo de congelamento com dimetilsulfóxido (DMSO) das células mesenquimais obtidas de tecido adiposo, submetidas pós descongelamento à diferenciação para linhagem condrogênica terá suas fibras de colágeno avaliadas através da técnica de Segundo Harmônico.
Pesquisador: Sergio Paulo Bydlowski/ Instituto: USP - SP
Células-tronco mesenquimais de liquido amniótico humano - Características dos processos de diferenciação e utilização em modelos animais de lesão de medula espinal e doença renal crônica.
Células-tronco mesenquimais são consideradas como células multipotentes que possuem potencial para se diferenciar em múltiplas linhagens celulares. Elas geraram uma grande expectativa como fonte potencial de células para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas, justamente por sua capacidade intrínseca de auto-renovação e diferenciação. São uma população rara na medula óssea de um ser humano adulto. Por outro lado, células-tronco embrionárias podem dar origem a qualquer tipo celular diferenciado muito mais eficazmente do que as células-tronco adultas, que proliferam apenas por um número limitado de gerações e cuja resposta a sinais de diferenciação diminui a cada geração. O isolamento de células-tronco embrionárias e sua utilização estão cercados de debates e questões éticas. Por outro lado, não há graves questões éticas na obtenção de células-tronco hematopoiéticas adultas, isoladas com relativa facilidade, mas difíceis de expandir sem que ocorra a diferenciação.
Uma alternativa às células-tronco embrionárias seria a utilização de células-tronco do líquido amniótico humano. Em nosso laboratório estamos há mais de dois anos estudando as características destas células obtidas ao redor da 20a semana de gestação, com bons resultados, com financiamento obtido de Edital anterior do CNPq sobre células-tronco.
Este projeto visa continuar este estudo, aprofundando-o, caracterizando melhor as células, avaliando a expressão gênica e de proteínas tanto nas células indiferenciadas como nas que serão diferenciadas. O comportamento de células que passaram por diferenciação condrogênica e osteogênica em scafolds serão avaliadas para posteriores estudos pré-clínicos envolvendo reparo de lesões de ossos e cartilagens. As condições de diversos procedimentos de criopreservação na manutenção das características celulares serão avaliadas. Também serão pesquisadas as características de nidificação destas células-tronco em camundongos.
Serão iniciados estudos pré-clínicos, com as células-tronco derivadas de líquido amniótico sendo aplicadas em duas situações experimentais em ratos. Em uma primeira, em modelo de insuficiência renal crônica. Em outra, em modelo de lesão da medula espinal, com indução de diferenciação neurogênica.
Uma alternativa às células-tronco embrionárias seria a utilização de células-tronco do líquido amniótico humano. Em nosso laboratório estamos há mais de dois anos estudando as características destas células obtidas ao redor da 20a semana de gestação, com bons resultados, com financiamento obtido de Edital anterior do CNPq sobre células-tronco.
Este projeto visa continuar este estudo, aprofundando-o, caracterizando melhor as células, avaliando a expressão gênica e de proteínas tanto nas células indiferenciadas como nas que serão diferenciadas. O comportamento de células que passaram por diferenciação condrogênica e osteogênica em scafolds serão avaliadas para posteriores estudos pré-clínicos envolvendo reparo de lesões de ossos e cartilagens. As condições de diversos procedimentos de criopreservação na manutenção das características celulares serão avaliadas. Também serão pesquisadas as características de nidificação destas células-tronco em camundongos.
Serão iniciados estudos pré-clínicos, com as células-tronco derivadas de líquido amniótico sendo aplicadas em duas situações experimentais em ratos. Em uma primeira, em modelo de insuficiência renal crônica. Em outra, em modelo de lesão da medula espinal, com indução de diferenciação neurogênica.
Pesquisador: Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros/ Instituto: UFRN - RN
Células-tronco mesenquimais humanas com cariótipo alterado apresentam alterações na estabilidade cromossômica e gênica no processo de diferenciação e de senescência in vitro na presença de titânio.
Células-tronco mesenquimais humanas (CTMH) são ótimas candidatas à terapia celular regenerativa, visto sua facilidade de isolamento e plasticidade funcional, mas devido ao baixo número de células, é necessária a realização de uma considerável expansão in vitro, antes de seu uso. Isto pode acarretar um envelhecimento bem como acúmulo de danos oxidativos e consequentemente à diminuição no potencial de proliferação e diferenciação, bem como levar a uma instabilidade genética. Uma das aplicações das CTMH é a regeneração óssea guiada, sendo o titânio o material mais empregado devido sua biocompatibilidade e durabilidade, porém vem sendo associado à geração de estresse oxidativo. Em estudos precedentes, nosso laboratório identificou uma inversão no cromossomo 3 em uma das linhagens primárias de CTMH existentes. No lócus da inversão estão localizados os genes OGG1, implicado no reparo de danos oxidativos no DNA e VHL que é um supressor tumoral. Assim, é objetivo deste trabalho investigar o potencial de susceptibilidade à transformação maligna de CTMH da veia do cordão umbilical com cariótipo alterado comparando-se com CTMH com cariótipo normal em diferentes condições de cultivo in vitro, na presença e na ausência de titânio, tratado ou não por plasma, e de fatores osteogênicos, antes e após a senescência.
Como resultado do presente projeto, espera-se a formação de recursos humanos, com perfil multidisciplinar, numa área de ponta e recente em nosso país, fortalecendo a pós-graduação no Nordeste, diminuindo assim, o desequilíbrio tecnológico entre as regiões brasileiras. Como produtos esperam-se gerar conhecimento a cerca da relação da inversão no braço curto do cromossomo 3 nos processos de: i) proliferação in vitro da CTMH, ii) osteogênese e iii) senescência, sempre na presença e/ou ausência de titânio modificado por plasma. Espera-se também compreender o papel das proteínas OGG1 e VHL nas células de cariótipo alterado, nos processos acima citados.
Através de uma técnica abrangente, proteômica diferencial, esperamos obter uma vasto padrão de expressão protéico que poderá ser usada para a compreensão do funcionamento das céluas em estado quiescente e em proliferação, crescidas ou não na presença de titânio, bem como de células com diferentes cariótipos, e assim poder contribuir na compreensão dos processos biológicos da diferenciação e estabilidade de células-tronco mesenquimais, originárias da veia do cordão umbilical. Este procedimento poderá gerar processos como o desenvolvimento de mecanismos de indução/inibição gênica específicos, que propiciam a diferenciação e estabilidade gênica das células-tronco mesenquimais. Além destes indicativos, os resultados advindos do presente projeto serão de extrema importância científica, pois estará contribuindo para incrementar o diagnóstico da estabilidade gênica de células-tronco de cordão umbilical antes e após diferenciação celular, questão fundamental para a transferência da tecnologia para aplicação em humanos na reposição de tecidos.
Como resultado do presente projeto, espera-se a formação de recursos humanos, com perfil multidisciplinar, numa área de ponta e recente em nosso país, fortalecendo a pós-graduação no Nordeste, diminuindo assim, o desequilíbrio tecnológico entre as regiões brasileiras. Como produtos esperam-se gerar conhecimento a cerca da relação da inversão no braço curto do cromossomo 3 nos processos de: i) proliferação in vitro da CTMH, ii) osteogênese e iii) senescência, sempre na presença e/ou ausência de titânio modificado por plasma. Espera-se também compreender o papel das proteínas OGG1 e VHL nas células de cariótipo alterado, nos processos acima citados.
Através de uma técnica abrangente, proteômica diferencial, esperamos obter uma vasto padrão de expressão protéico que poderá ser usada para a compreensão do funcionamento das céluas em estado quiescente e em proliferação, crescidas ou não na presença de titânio, bem como de células com diferentes cariótipos, e assim poder contribuir na compreensão dos processos biológicos da diferenciação e estabilidade de células-tronco mesenquimais, originárias da veia do cordão umbilical. Este procedimento poderá gerar processos como o desenvolvimento de mecanismos de indução/inibição gênica específicos, que propiciam a diferenciação e estabilidade gênica das células-tronco mesenquimais. Além destes indicativos, os resultados advindos do presente projeto serão de extrema importância científica, pois estará contribuindo para incrementar o diagnóstico da estabilidade gênica de células-tronco de cordão umbilical antes e após diferenciação celular, questão fundamental para a transferência da tecnologia para aplicação em humanos na reposição de tecidos.
Pesquisador: Stevens Rehen/ Instituto: ICB/UFRJ - RJ
Geração de células-tronco de pluripotência induzida a partir de células adultas humanas visando aplicação biotecnológica.
Em 2006, um trabalho científico revolucionário conseguiu, pela primeira vez, transformar uma célula de pele em uma célula pluripotente. Essas células, chamadas de células-tronco de pluripotência induzida (iPS), foram criadas a partir de fibroblastos (células presentes na pele) infectados com vírus que carreavam cópias de quatro genes envolvidos com a pluripotencialidade e proliferação celular. Dessa forma, as células adultas (fibroblastos) foram reprogramadas e passaram a se comportar como células-tronco embrionárias, sendo capazes de se diferenciar em eventualmente qualquer tipo celular do organismo.
A partir desse trabalho, um novo mundo de possibilidades surgiu. Agora seria possível criar modelos específicos para o estudo de doenças, do desenvolvimento embrionário e da diferenciação celular. Diversos grupos começaram a fazer suas próprias células de pluripotência induzida e, em 2009, nosso grupo derivou suas primeiras iPS (e acrescentou o Brasil ao seleto grupo de países que já haviam produzido esse tipo de células até aquele momento - Japão, China, Alemanha e Estados unidos).
Atualmente, esta linha de pesquisa pretende gerar células-tronco de pluripotência induzida através da técnica de reprogramação celular com vírus. No momento, já foram obtidas células iPS a partir de fibroblastos murinos (de camundongos) e humanos, além de fibroblastos derivados de pacientes com transtornos mentais. Agora, com a técnica consolidada em nosso laboratório, a gama de doenças estudas via geração de iPS tende a aumentar. Além da produção de células iPS, também buscamos o estudo das doenças modeladas a partir das células, visando elucidar possíveis mecanismos envolvidos com as patologias.
Outro benefício das iPS é que elas podem ser geradas a partir do próprio paciente e, eventualmente, serem usadas como fonte para terapia celular autóloga. Isso elimina o risco de rejeição e, consequentemente, aumenta a chance de sucesso do transplante. Nesse sentido, as iPS geradas em nosso laboratório serão empregadas em modelos animais de doenças neurodegenerativas, como o Parkinson, e também em modelos de lesão medular.
A partir desse trabalho, um novo mundo de possibilidades surgiu. Agora seria possível criar modelos específicos para o estudo de doenças, do desenvolvimento embrionário e da diferenciação celular. Diversos grupos começaram a fazer suas próprias células de pluripotência induzida e, em 2009, nosso grupo derivou suas primeiras iPS (e acrescentou o Brasil ao seleto grupo de países que já haviam produzido esse tipo de células até aquele momento - Japão, China, Alemanha e Estados unidos).
Atualmente, esta linha de pesquisa pretende gerar células-tronco de pluripotência induzida através da técnica de reprogramação celular com vírus. No momento, já foram obtidas células iPS a partir de fibroblastos murinos (de camundongos) e humanos, além de fibroblastos derivados de pacientes com transtornos mentais. Agora, com a técnica consolidada em nosso laboratório, a gama de doenças estudas via geração de iPS tende a aumentar. Além da produção de células iPS, também buscamos o estudo das doenças modeladas a partir das células, visando elucidar possíveis mecanismos envolvidos com as patologias.
Outro benefício das iPS é que elas podem ser geradas a partir do próprio paciente e, eventualmente, serem usadas como fonte para terapia celular autóloga. Isso elimina o risco de rejeição e, consequentemente, aumenta a chance de sucesso do transplante. Nesse sentido, as iPS geradas em nosso laboratório serão empregadas em modelos animais de doenças neurodegenerativas, como o Parkinson, e também em modelos de lesão medular.
Pesquisador: Tatiana Lobo Coelho de Sampaio/ Instituto: UFRJ - RJ
Terapia celular para lesões raquimedulares crônicas e agudas.
O projeto aqui proposto pretende investigar o potencial regenerativo de 3 tipos celulares, células mesenquimais do tecido adiposo, células tronco neurais da mucosa olfativa e células da glia embainhante olfativa, em lesões raquimedulares agudas e crônicas, induzidas experimentalmente em ratos. O consórcio de laboratórios que apresenta o projeto é composto por 3 grupos que vêm trabalhando juntos há quatro anos no estabelecimento do modelo de estudo das lesões raquimedulares (ver pedido de patente PI 0704128-4, INPI).
O projeto foi construído sobre as seguintes premissas: 1) dados preliminares do grupo mostraram que células mesenquimais do tecido adiposo promovem recuperação tecidual e funcional após lesão raquimedular experimental; 2) a mucosa olfatória e o tecido adiposo humano são de fácil obtenção para transplantes autólogos; 3) tanto as células mesenquimais de tecido adiposo quanto as células, isoladas ou não, da mucosa olfatória, já foram testadas em seres humanos, sem que houvesse relato de complicações; 4) as terapias celulares aqui propostas podem facilmente ser combinadas a outras terapias. Este conjunto de elementos favoráveis aliado à experiência prévia do grupo nos levam a crer que o projeto ora proposto apresenta grandes chances de sucesso.
O projeto foi construído sobre as seguintes premissas: 1) dados preliminares do grupo mostraram que células mesenquimais do tecido adiposo promovem recuperação tecidual e funcional após lesão raquimedular experimental; 2) a mucosa olfatória e o tecido adiposo humano são de fácil obtenção para transplantes autólogos; 3) tanto as células mesenquimais de tecido adiposo quanto as células, isoladas ou não, da mucosa olfatória, já foram testadas em seres humanos, sem que houvesse relato de complicações; 4) as terapias celulares aqui propostas podem facilmente ser combinadas a outras terapias. Este conjunto de elementos favoráveis aliado à experiência prévia do grupo nos levam a crer que o projeto ora proposto apresenta grandes chances de sucesso.
Pesquisador: Verônica Maria Morandi da Silva/ Instituto: UERJ - RJ
Papel da adesão celular no recrutamento de progenitores endoteliais circulantes por sítios isquêmicos: estudos in vitro e in vivo.
A modulação da aderência de células endoteliais por moléculas da matriz extracelular ou seus fragmentos (matricinas), que interagem com receptores celulares (integrinas, proteoglicanas etc.) influencia a sobrevivência celular e o processo angiogênico. Nosso laboratório desenvolve estudos sobre o papel da trombospondina-1 (TSP-1) na angiogênese. Neste projeto, o foco é o estudo das células endoteliais progenitoras (EPCs), atualmente consideradas essenciais para a angiogênese associada ao reparo de lesões isquêmicas e ao câncer. Nós demonstramos os efeitos pró-angiogênicos de um fragmento de 18 kDa da TSP-1 (TSP18), bem como a identificamos duas seqüências contendo o motivo-consenso BBXB de interação com GAGs, mimetizadoras do efeito.
Mostramos ainda que o efeito pró-angiogênico destes peptídeos é mediado pelo sindecan-4, um proteoglicano de heparan-sulfato da superfície endotelial fundamental para a estabilização dos contatos focais. A identificação do sindecan-4 como um novo alvo para a modulação angiogênica nos levou ao interesse em nos aprofundarmos nos mecanismos de ação destas diferentes moléculas. Pretendemos estabelecer as especificidades desta regulação, já caracterizada em células endoteliais maduras, também em EPCs isoladas de sangue periférico de adultos. Dados preliminares indicam que peptídeos pró-angiogênicos da TSP-1 podem estimular a revascularização de sítios isquêmicos. Pretendemos investigar se o sindecan-4 está envolvido neste evento e se ele implica no recrutamentos de progenitores endoteliais circulantes. Utilizaremos modelos experimentais baseados em células endoteliais transfectadas, seja para superexpressarem ou para terem silenciada a expressão do sindecan-4 em suas superfícies. A proliferação, diferenciação, mobilização e incorporação destas células ao endotélio maduro serão estudadas in vitro e também in vivo (uso de modelos de isquemia experimental).
Mostramos ainda que o efeito pró-angiogênico destes peptídeos é mediado pelo sindecan-4, um proteoglicano de heparan-sulfato da superfície endotelial fundamental para a estabilização dos contatos focais. A identificação do sindecan-4 como um novo alvo para a modulação angiogênica nos levou ao interesse em nos aprofundarmos nos mecanismos de ação destas diferentes moléculas. Pretendemos estabelecer as especificidades desta regulação, já caracterizada em células endoteliais maduras, também em EPCs isoladas de sangue periférico de adultos. Dados preliminares indicam que peptídeos pró-angiogênicos da TSP-1 podem estimular a revascularização de sítios isquêmicos. Pretendemos investigar se o sindecan-4 está envolvido neste evento e se ele implica no recrutamentos de progenitores endoteliais circulantes. Utilizaremos modelos experimentais baseados em células endoteliais transfectadas, seja para superexpressarem ou para terem silenciada a expressão do sindecan-4 em suas superfícies. A proliferação, diferenciação, mobilização e incorporação destas células ao endotélio maduro serão estudadas in vitro e também in vivo (uso de modelos de isquemia experimental).
Pesquisador: Verônica Porto Carreiro de Vasconcellos Coelho/ Instituto: USP/INCOR - SP
Células-tronco mesenquimais e células T reguladoras do tecido adiposo humano: interação e imunorregulação.
As células mesenquimais humanas (MSC) têm importante papel na hematopoiese e mais recentemente, sua capacidade imunoreguladora tem sido descrita. As MSC derivadas do tecido adiposo (Ad-MSC) podem ser uma fonte alternativa para as BM-MSC uma vez que também podem ser facilmente expandidas in vitro. Apesar de essas células apresentarem um potencial terapêutico, ainda existe poucos estudos avaliando as propriedades imunoreguladoras deste tipo celular. A atividade supressora exercida pelas MSC parece envolver uma variedade de mecanismos que podem depender tanto da heterogeneidade das populações de MSC – ainda pouco conhecidas - como da natureza do estímulo antigênico, do microambiente e de fatores solúveis nele presentes Dessa maneira, no presente estudo temos como objetivo comparar a capacidade.
Acreditamos que uma análise mais global de moléculas envolvidas tanto em imunorregulação, como na indução de uma resposta inflamatória, poderá nos fornecer informações importantes sobre os múltiplos fatores envolvidos na interação de células do sistema imune com as MSC. Isso nos permitirá avaliar se o equilíbrio entre fatores pró-inflamatórios (INFLAMA) e imunorreguladores (REGULA) pode contribuir no desfecho final da atividade supressora das MSC. Ademais, explorar o efeito da interação entre as MSC derivadas de tecido adiposo com as células T CD4+/CD25+ residentes no mesmo microambiente, poderá contribuir para a melhor compreensão sobre mecanismos envolvidos na comunicação entre esses dois tipos celulares e em potenciais efeitos sinérgicos imunorreguladores.
Acreditamos que uma análise mais global de moléculas envolvidas tanto em imunorregulação, como na indução de uma resposta inflamatória, poderá nos fornecer informações importantes sobre os múltiplos fatores envolvidos na interação de células do sistema imune com as MSC. Isso nos permitirá avaliar se o equilíbrio entre fatores pró-inflamatórios (INFLAMA) e imunorreguladores (REGULA) pode contribuir no desfecho final da atividade supressora das MSC. Ademais, explorar o efeito da interação entre as MSC derivadas de tecido adiposo com as células T CD4+/CD25+ residentes no mesmo microambiente, poderá contribuir para a melhor compreensão sobre mecanismos envolvidos na comunicação entre esses dois tipos celulares e em potenciais efeitos sinérgicos imunorreguladores.
Pesquisador: Walace Gomes Leal/ Instituto: UFPA - PA
Bloqueio da ativação microglial para a maximização dos efeitos neuroprotetores de células-tronco mesenquimais da medula óssea transplantadas endovenosamente apos acidente vascular encefálico experimental.
Uma das principais hipóteses postuladas para os efeitos benéficos do transplante de células-tronco da medula óssea é de que este procedimento amplificaria os mecanismos de reparo endógeno. Por outro lado, sabe-se que a ativação microglial durante a isquemia experimental prejudica a neurogênese em regiões do SNC, como o hipocampo. Além disso, estudos recentes sugerem que o ambiente inflamatório, incluindo a ativação microglial, influencia as propriedades terapêuticas das células tronco transplantadas. Uma questão importante é o momento certo de realizar o transplante após a ocorrência do acidente vascular encefálico. O mesmo deve-se ser realizado na fase aguda da doença, quando o processo inflamatório é mais intenso, ou na fase mais crônica, quando a resposta inflamatória é mais branda? É possível que as ações terapêuticas das células tronco transplantadas sejam influenciadas pelo processo inflamatório. Inexistem estudos que tenham investigado a influência da resposta inflamatória sobre as ações terapêuticas das células trasplantadas.
O presente projeto pretende investigar se o bloqueio da resposta microglial em animais transplantados com células-tronco da medula óssea induz neuroproteção, neurogênese e recuperação motora mais eficazes, como avaliado por técnicas histológicas e análise comportamental. Com base no exposto acima, o presente projeto investigará a hipótese de que o tratamento de animais isquêmicos com células-tronco da medula óssea em concomitância com o bloqueio da ativação microglial pode induzir proteção tecidual, neurogênese e, recuperação funcional mais eficazes do que a simples terapia celular sem o bloqueio da resposta inflamatória. Nossos estudos preliminares sugerem que o bloqueio microglial favorece as ações terapêuticas de células tronco da medula óssea transplantadas endovenosamente no córtex motor isquêmico, criando um ambiente menos inflamatório que favorece a neuroproteção.
O presente projeto pretende investigar se o bloqueio da resposta microglial em animais transplantados com células-tronco da medula óssea induz neuroproteção, neurogênese e recuperação motora mais eficazes, como avaliado por técnicas histológicas e análise comportamental. Com base no exposto acima, o presente projeto investigará a hipótese de que o tratamento de animais isquêmicos com células-tronco da medula óssea em concomitância com o bloqueio da ativação microglial pode induzir proteção tecidual, neurogênese e, recuperação funcional mais eficazes do que a simples terapia celular sem o bloqueio da resposta inflamatória. Nossos estudos preliminares sugerem que o bloqueio microglial favorece as ações terapêuticas de células tronco da medula óssea transplantadas endovenosamente no córtex motor isquêmico, criando um ambiente menos inflamatório que favorece a neuroproteção.
Pesquisador: William Dias Belangero/ Instituto: UNICAMP - SP
Estudo da aplicação de células mesenquimais obtidas de tecido adiposo humano associadas a scaffolds de ß-fosfato tricalcio (ß-TCP), fosfato de cálcio Ca3(PO4)2 e hidrogel de hialuronato de sódio
As células mesenquimais adultas correspondem a um grupo de células que podem ser obtidas do tecido adiposo e in vitro possuem a capacidade de se diferenciar em tecido ósseo que por sua vez poderão auxiliar no tratamento de defeitos ósseos ocasionados por infecções, tumores e traumas. Atualmente na prática clínica usa-se enxerto autólogo de diferentes regiões do esqueleto mas mesmo assim a fonte doadora é insuficiente no caso de grandes perdas e a sua retirada pode produzir complicações para o paciente como infecção dor e parestesias. O tecido adiposo humano obtido da lipoaspiração pode ser processado para se obter células mesenquimais (MSC/TA) que sob condições ideais de cultivo podem se diferenciar em células osteogênicas com grande potencial de uso para o tratamento dos defeitos ósseos já citados. Esta nova perspectiva terapêutica gera a necessidade de se realizar estudos pré-clínicos para avaliar efetivamente o potencial de uso dessa fonte de células MSC/TA.
Outra perspectiva importante que deve ser analisada é o uso de scaffolds associados às MSC/TA para otimizar o tratamento dos defeitos ósseos. Assim, o presente projeto tem como objetivo utilizar células osteogênicas associadas a scaffolds de ß-Fosfato Tricálcio (ß-TCP); Fosfato de Cálcio Ca3(PO4)2 e hidrogel de hialuronato de sódio como carreadores para resolver defeitos ósseos críticos produzidos na região metafisária proximal da tíbia de ratos da linhagem Wistar.
Os ß-Fosfato Tricálcio (ß-TCP); Fosfato de Cálcio Ca3(PO4)2 e hidrogéis de hialuronato de sódio foram selecionados por serem materiais biocompatíveis, biodegradáveis, porosos com composição química semelhante à do osso humano já usados utilizada a prática clínica como indutores da regeneração óssea. O Fosfato de Cálcio Ca3(PO4)2 possui características semelhantes ao ß-TCP, porém são obtidos a partir de sementes de mamão (fosfatos naturais). Já o hidrogel de hialuronato de sódio apresenta características diferenciadas podendo ser confeccionado com diferentes morfologias e propriedade especifica para cada tipo de aplicação.
Outra perspectiva importante que deve ser analisada é o uso de scaffolds associados às MSC/TA para otimizar o tratamento dos defeitos ósseos. Assim, o presente projeto tem como objetivo utilizar células osteogênicas associadas a scaffolds de ß-Fosfato Tricálcio (ß-TCP); Fosfato de Cálcio Ca3(PO4)2 e hidrogel de hialuronato de sódio como carreadores para resolver defeitos ósseos críticos produzidos na região metafisária proximal da tíbia de ratos da linhagem Wistar.
Os ß-Fosfato Tricálcio (ß-TCP); Fosfato de Cálcio Ca3(PO4)2 e hidrogéis de hialuronato de sódio foram selecionados por serem materiais biocompatíveis, biodegradáveis, porosos com composição química semelhante à do osso humano já usados utilizada a prática clínica como indutores da regeneração óssea. O Fosfato de Cálcio Ca3(PO4)2 possui características semelhantes ao ß-TCP, porém são obtidos a partir de sementes de mamão (fosfatos naturais). Já o hidrogel de hialuronato de sódio apresenta características diferenciadas podendo ser confeccionado com diferentes morfologias e propriedade especifica para cada tipo de aplicação.
Pesquisador: Wilson Savino / Instituto: FIOCRUZ - RJ
Terapia celular em distrofias musculares
O transplante de células precursoras de músculo esquelético tem sido visto como uma estratégia em potencial no tratamento de distrofias musculares.
No entanto, apesar de já ter sido utilizada em diferentes modelos, ainda é baixa a eficácia da transferência destes precursores miogênicos e a manutenção dos mesmos no tecido muscular receptor, após os procedimentos de terapia celular. Nesse sentido, de um lado temos como obstáculo óbvio a resposta imune adaptativa do indivíduo receptor ao transplante, e de outro lado o próprio microambiente tecidual muscular onde as células são transplantadas. Neste projeto, pretendemos abordar estes dois aspectos, utilizando modelo de terapia celular com precursores miogênicos humanos injetados em camundongos imunodeficientes ou imunocompetentes.
No que diz respeito aos mecanismos moleculares intrínsecos ao tecido muscular, e envolvidos na sobrevida e dispersão de precursores miogênicos humanos após inoculação em animais imunodeficientes, pretendemos determinar:
1) A expressão intramuscular de moléculas de matriz extracelular, quimiocinas, citocinas e metaloproteases de matriz extracelular que possam estar envolvidas no influxo de células inflamatórias durante o processo de pega das células transplantadas para fins de terapia celular;
2) O padrão de expressão de moléculas pró-apoptóticas (incluindo vias de morte celular) expressas por mioblastos humanos antes e após o procedimento de terapia celular;
3) O efeito de moléculas de moléculas de ECM, associadas ou não a quimiocinas ou fatores de crescimento, sobre a migração ex-vivo de precursores miogênicos;
4) O efeito de metaloproteinases de matriz sobre a migração ex-vivo de precursores miogênicos induzida por moléculas de ECM, associadas ou não a quimiocinas;
5) O grau de dispersão e de apoptose de precursores miogênicos humanos in vivo, dentro do músculo receptor de camundongos, após tratamento com moléculas de ECM, em combinação ou não com quimiocinas, particularmente CXCL12.
Uma segunda abordagem terapêutica no sentido de melhorar as condições de transplante de precursores miogênicos humanos em modelo murino é de induzir, em animais receptores imunocompetentes, tolerância imunológica às células que serão transplantadas no tecido muscular. Nesse sentido, pretendemos testar duas estratégias diferentes para gerar tolerância central.
a) Injeção intratímica de mioblastos humanos (ou extratos obtidos a partir destas células) em camundongos normais imediatamente submetidos à irradiação letal e transferidos com precursores totipotentes de medula óssea, oriundos de animais singênicos. Nesta situação, os animais deverão reconstituir seu repertório de células T no timo, em presença de moléculas derivadas de humanas, induzindo deleção de clones de células T expressando receptores de antígeno específicos para epítopos destas moléculas. Assim, pela via de seleção negativa, podemos esperar uma diminuição importante de resposta imune contra as células que serão posteriormente transplantadas no músculo receptor.
b) Irradiação letal dos animais, seguida de injeção de precursores de medula óssea juntamente com os mioblastos humanos. Uma vez os precursores miogênicos chegando no timo, este segundo protocolo também deverá gerar tolerância central, e por conseguinte condições imunológicas permissivas à posterior transplantação xenogênica de precursores miogênicos humanos.
Aquele protocolo que der melhores resultados em termos de tolerância será utilizado posteriormente em camundongos mdx, seguido de uma analise do tecido muscular, após transplantação de células humanas.
Não temos dúvida que o conhecimento acumulado sobre os fatores que influenciam sobre a sobrevivência, expansão, dispersão e diferenciação destes precursores in vivo será de grande importância para futuro delineamento de novos ensaios terapêuticos. Além disso, os dados obtidos sobre geração de tolerância imunológica permitirão uma base teórica mais concreta para delinearmos protocolos terapêuticos a serem testados em indivíduos imunocompetentes. Tomadas em conjunto, essas duas abordagens conceituais representam um caráter inovador em termos de protocolos de terapia celular visando à correção futura de distrofias musculares.
Em conclusão, a possibilidade de abordarmos, de um lado as questões biológicas intrínsecas ao nicho ecológico que recebe o transplante de precursores miogênicos humanos, e de outro lado a indução de tolerância imunológica a tais células, deverá trazer contribuição significativa, para obtermos maior eficácia de transplante de precursores miogênicos em indivíduos imunocompetentes.
No entanto, apesar de já ter sido utilizada em diferentes modelos, ainda é baixa a eficácia da transferência destes precursores miogênicos e a manutenção dos mesmos no tecido muscular receptor, após os procedimentos de terapia celular. Nesse sentido, de um lado temos como obstáculo óbvio a resposta imune adaptativa do indivíduo receptor ao transplante, e de outro lado o próprio microambiente tecidual muscular onde as células são transplantadas. Neste projeto, pretendemos abordar estes dois aspectos, utilizando modelo de terapia celular com precursores miogênicos humanos injetados em camundongos imunodeficientes ou imunocompetentes.
No que diz respeito aos mecanismos moleculares intrínsecos ao tecido muscular, e envolvidos na sobrevida e dispersão de precursores miogênicos humanos após inoculação em animais imunodeficientes, pretendemos determinar:
1) A expressão intramuscular de moléculas de matriz extracelular, quimiocinas, citocinas e metaloproteases de matriz extracelular que possam estar envolvidas no influxo de células inflamatórias durante o processo de pega das células transplantadas para fins de terapia celular;
2) O padrão de expressão de moléculas pró-apoptóticas (incluindo vias de morte celular) expressas por mioblastos humanos antes e após o procedimento de terapia celular;
3) O efeito de moléculas de moléculas de ECM, associadas ou não a quimiocinas ou fatores de crescimento, sobre a migração ex-vivo de precursores miogênicos;
4) O efeito de metaloproteinases de matriz sobre a migração ex-vivo de precursores miogênicos induzida por moléculas de ECM, associadas ou não a quimiocinas;
5) O grau de dispersão e de apoptose de precursores miogênicos humanos in vivo, dentro do músculo receptor de camundongos, após tratamento com moléculas de ECM, em combinação ou não com quimiocinas, particularmente CXCL12.
Uma segunda abordagem terapêutica no sentido de melhorar as condições de transplante de precursores miogênicos humanos em modelo murino é de induzir, em animais receptores imunocompetentes, tolerância imunológica às células que serão transplantadas no tecido muscular. Nesse sentido, pretendemos testar duas estratégias diferentes para gerar tolerância central.
a) Injeção intratímica de mioblastos humanos (ou extratos obtidos a partir destas células) em camundongos normais imediatamente submetidos à irradiação letal e transferidos com precursores totipotentes de medula óssea, oriundos de animais singênicos. Nesta situação, os animais deverão reconstituir seu repertório de células T no timo, em presença de moléculas derivadas de humanas, induzindo deleção de clones de células T expressando receptores de antígeno específicos para epítopos destas moléculas. Assim, pela via de seleção negativa, podemos esperar uma diminuição importante de resposta imune contra as células que serão posteriormente transplantadas no músculo receptor.
b) Irradiação letal dos animais, seguida de injeção de precursores de medula óssea juntamente com os mioblastos humanos. Uma vez os precursores miogênicos chegando no timo, este segundo protocolo também deverá gerar tolerância central, e por conseguinte condições imunológicas permissivas à posterior transplantação xenogênica de precursores miogênicos humanos.
Aquele protocolo que der melhores resultados em termos de tolerância será utilizado posteriormente em camundongos mdx, seguido de uma analise do tecido muscular, após transplantação de células humanas.
Não temos dúvida que o conhecimento acumulado sobre os fatores que influenciam sobre a sobrevivência, expansão, dispersão e diferenciação destes precursores in vivo será de grande importância para futuro delineamento de novos ensaios terapêuticos. Além disso, os dados obtidos sobre geração de tolerância imunológica permitirão uma base teórica mais concreta para delinearmos protocolos terapêuticos a serem testados em indivíduos imunocompetentes. Tomadas em conjunto, essas duas abordagens conceituais representam um caráter inovador em termos de protocolos de terapia celular visando à correção futura de distrofias musculares.
Em conclusão, a possibilidade de abordarmos, de um lado as questões biológicas intrínsecas ao nicho ecológico que recebe o transplante de precursores miogênicos humanos, e de outro lado a indução de tolerância imunológica a tais células, deverá trazer contribuição significativa, para obtermos maior eficácia de transplante de precursores miogênicos em indivíduos imunocompetentes.
Pesquisador : Rubens Camargo Siqueira / Instituto: USP Ribeirão Preto.
Uso de células-tronco derivadas da medula óssea para tratamento de doenças da retina.
Existem diversos tipos de retinopatias que podem resultar em cegueira. Algumas têm origem genética e acometem indivíduos desde seu nascimento, outras são doenças crônicas degenerativas, como a retinopatia diabética, com uma maior incidência na população acima de 50 anos.
Distrofias hereditárias da retina como por exemplo a retinose pigmentar afetam 1 em cada 3000 indivíduos e são caracterizadas por cegueira noturna progressiva, perda do campo visual, atrofia óptica , atenuação arteriolar , permeabilidade vascular alterada e perda da visão central progressiva com cegueira completa . Análise genética molecular destas doenças tem identificado acima de 110 diferentes genes foram identificados até o momento responsáveis pelo desencadeamento destas entidades que não possuem tratamento ate o momento.
Outra importante doença é a degeneração macular relacionada à idade (DMRI) que é a principal causa de cegueira na população acima de 55 anos. Sua prevalência aumenta com a idade afetando cerca de 8,5 a 27,9% da população maior que 75 anos . Tem sido observado que a incidência dessa doença vem aumentando nas últimas décadas na ordem de 30 a 40%, apesar de doenças oftalmológicas como a catarata e glaucoma, que atingem a mesma faixa populacional, terem apresentado, aparentemente, redução dos seus registros .
Apesar da etiologia não ter sido ainda determinada, tem sido mostrado que fatores ambientais e genéticos podem estar envolvidos . Um insulto oxidativo que resulta na morte de fotorreceptores da mácula poderia ser a gênese do processo .
E por fim as doenças vasculares da retina que levam a isquemia , condição esta que ainda não possui tratamento para reversão funcional do tecido retiniano levando a cegueira. Dentre as causas da retinopatia isquêmica , a retinopatia diabética é a mais frequente no mundo.
De acordo com a Organização Mundial de Saúde mais de 220 milhões de pessoas têm diabetes.
A ausência de tratamentos eficazes para grande parte das doenças degenerativas da retina, associada ao aumento da longevidade e incidência de diabetes, só fará crescer este número.
Estamos realizando 3 estudos clínicos autorizados pelo Comitê Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) com uso de células tronco derivadas da medula óssea para tratamento das seguintes doenças:
1) Degenerações hereditárias da retina (retinose pigmentar) - Iniciado 2009
2) Degeneração macular relacionada com a idade (DMRI) - Iniciado 2011
3) Retinopatia isquêmica (retinopatia diabética) - Iniciado 2011
Distrofias hereditárias da retina como por exemplo a retinose pigmentar afetam 1 em cada 3000 indivíduos e são caracterizadas por cegueira noturna progressiva, perda do campo visual, atrofia óptica , atenuação arteriolar , permeabilidade vascular alterada e perda da visão central progressiva com cegueira completa . Análise genética molecular destas doenças tem identificado acima de 110 diferentes genes foram identificados até o momento responsáveis pelo desencadeamento destas entidades que não possuem tratamento ate o momento.
Outra importante doença é a degeneração macular relacionada à idade (DMRI) que é a principal causa de cegueira na população acima de 55 anos. Sua prevalência aumenta com a idade afetando cerca de 8,5 a 27,9% da população maior que 75 anos . Tem sido observado que a incidência dessa doença vem aumentando nas últimas décadas na ordem de 30 a 40%, apesar de doenças oftalmológicas como a catarata e glaucoma, que atingem a mesma faixa populacional, terem apresentado, aparentemente, redução dos seus registros .
Apesar da etiologia não ter sido ainda determinada, tem sido mostrado que fatores ambientais e genéticos podem estar envolvidos . Um insulto oxidativo que resulta na morte de fotorreceptores da mácula poderia ser a gênese do processo .
E por fim as doenças vasculares da retina que levam a isquemia , condição esta que ainda não possui tratamento para reversão funcional do tecido retiniano levando a cegueira. Dentre as causas da retinopatia isquêmica , a retinopatia diabética é a mais frequente no mundo.
De acordo com a Organização Mundial de Saúde mais de 220 milhões de pessoas têm diabetes.
A ausência de tratamentos eficazes para grande parte das doenças degenerativas da retina, associada ao aumento da longevidade e incidência de diabetes, só fará crescer este número.
Estamos realizando 3 estudos clínicos autorizados pelo Comitê Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) com uso de células tronco derivadas da medula óssea para tratamento das seguintes doenças:
1) Degenerações hereditárias da retina (retinose pigmentar) - Iniciado 2009
2) Degeneração macular relacionada com a idade (DMRI) - Iniciado 2011
3) Retinopatia isquêmica (retinopatia diabética) - Iniciado 2011
Pesquisador: Arnaldo Rodrigues dos Santos Jr / Instituto: UFABC
Uso de biomateriais e células-tronco mesenquimais regeneração e engenharia tecidual aplicada a traumatologia.
A Engenharia Tecidual se refere à combinação de métodos da Biologia Celular e Tecidual com a Engenharia e Cirurgia, para elucidar as relações estrutura-função em tecidos normais e doentes visando a reparação ou substituição desses, pode ser utilizada em conjunto com a utilização de biomateriais na forma de arcabouços (ou scaffolds) desenvolvidos para preencher e reparar os tecidos lesados.
Dentre os materiais que podem construir os arcabouços estão os polímeros biorreabsorvíveis, que quando implantados, são eliminados do organismo por vias fisiológicas. As células-tronco são vistas como possível solução para terapia celular e regeneração tecidual. As células-tronco mesenquimais tem uma grande capacidade de multiplicação e diferenciação, além de serem facilmente obtidas e utilizadas.
Objetivamos a utilização de células-tronco mesenquimais consiste na indução da diferenciação em um determinado tipo celular, estimulando sua multiplicação e inserindo essas células em tecidos danificados. A perspectiva de utilização de células-tronco mesenquimais, torna necessário a padronização de seus métodos de obtenção, manutenção e diferenciação específicas, associada a necessidade de estudos pré-clínicos e clínicos para se avaliar efetivamente o seu potencial terapêutico. A partir destes estudos, propomos a avaliação de arcabouços concebidos para serem utilizados em pacientes com problemas severos lesão tecidual. Nossa linha de investigação objetiva a padronização das metodologias para a obtenção e cultivo celular, da sua indução à diferenciação de células-tronco mesenquimais, com a utilização destas para testes de biocompatibilidade de materiais voltados à construção de suportes para reparo tecidual, enfocando basicamente reparo ósseo e tegumentar.
Dentre os materiais que podem construir os arcabouços estão os polímeros biorreabsorvíveis, que quando implantados, são eliminados do organismo por vias fisiológicas. As células-tronco são vistas como possível solução para terapia celular e regeneração tecidual. As células-tronco mesenquimais tem uma grande capacidade de multiplicação e diferenciação, além de serem facilmente obtidas e utilizadas.
Objetivamos a utilização de células-tronco mesenquimais consiste na indução da diferenciação em um determinado tipo celular, estimulando sua multiplicação e inserindo essas células em tecidos danificados. A perspectiva de utilização de células-tronco mesenquimais, torna necessário a padronização de seus métodos de obtenção, manutenção e diferenciação específicas, associada a necessidade de estudos pré-clínicos e clínicos para se avaliar efetivamente o seu potencial terapêutico. A partir destes estudos, propomos a avaliação de arcabouços concebidos para serem utilizados em pacientes com problemas severos lesão tecidual. Nossa linha de investigação objetiva a padronização das metodologias para a obtenção e cultivo celular, da sua indução à diferenciação de células-tronco mesenquimais, com a utilização destas para testes de biocompatibilidade de materiais voltados à construção de suportes para reparo tecidual, enfocando basicamente reparo ósseo e tegumentar.
